高振剛, 曾莎莎, 曾鴻鵠，2，3, 梁延鵬*，2，3, 覃禮堂，2，3, 宋曉紅，2，3

(1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004；3.巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林 541004)

有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus Pesticides，OPs)以其高效致毒、快速降解的特性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛施用[1]。自2015年農(nóng)業(yè)部頒布《到2020年農(nóng)藥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)方案》以來(lái)，OPs的施用量雖有所下降，但是敵百蟲、敵敵畏、毒死蜱和辛硫磷等10種OPs每年的使用量仍達(dá)到1 000～3 0000噸[2]。理論上OPs被施用后，自然條件下能降解為無(wú)毒的無(wú)機(jī)磷，但水環(huán)境中OPs的不斷檢出證明存在OPs污染。因此，有必要建立水中多種OPs的檢測(cè)方法。

目前，水環(huán)境樣品常用的前處理方法有液-液萃取(LLE)[3]和固相萃取(SPE)[4]，其中SPE效果穩(wěn)定、溶劑用量少，有利于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。富集OPs常用的SPE小柱有C18柱[5]和HLB柱[6]，均為反相SPE柱，適用于非極性至中等極性的化合物，對(duì)多數(shù)OPs有較好的萃取效果，但對(duì)強(qiáng)極性O(shè)Ps萃取效果較差。而活性炭柱屬于無(wú)機(jī)吸附型SPE柱，適用于強(qiáng)極性有機(jī)污染物的富集[7]。OPs的分析多采用氣相色譜(GC)法[8]，其主要針對(duì)易氣化且熱穩(wěn)定的物質(zhì)。OPs種類較多，理化性質(zhì)差異大，分子質(zhì)量較大，多具有強(qiáng)極性和熱不穩(wěn)定性，采用液相色譜(LC)法更具優(yōu)越性[9]。但色譜法僅靠保留時(shí)間定性，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[10,11]，而與質(zhì)譜聯(lián)用使色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)得到互補(bǔ)，具有更好的靈敏度與準(zhǔn)確度，在極性差異大的農(nóng)藥多殘留分析方面具有突出的優(yōu)勢(shì)[12]。本研究對(duì)固相萃取柱及洗脫液進(jìn)行優(yōu)化選擇，建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC-MS/MS)法同時(shí)檢測(cè)水中16種OPs殘留的分析方法，適用于水中多種痕量OPs的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S Micro超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters公司)；AQUA Trace ASPE 799型固相萃取儀(日本，島津公司)；雙頻超聲波清洗器；24位氮吹儀;Waters Oasis HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國(guó)Waters公司)；椰子殼活性炭AC固相萃取柱(500 mg，6 mL，德國(guó)CNW公司)；HF Bond Elut-C18固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國(guó)Agilent公司)。

16種標(biāo)樣包含敵敵畏、氧樂(lè)果、樂(lè)果、甲胺磷、乙酰甲胺磷、久效磷、滅線磷、辛硫磷、對(duì)硫磷、敵百蟲、水胺硫磷、殺撲磷、三唑磷、氯唑磷、馬拉硫磷和毒死蜱，純度≥98%(美國(guó)o2si公司)，該標(biāo)樣質(zhì)量濃度為100 μg/mL，介質(zhì)為甲醇，使用時(shí)將其稀釋至2 μg/mL制成儲(chǔ)備液，避光，-20 ℃冰箱保存。甲醇(色譜純，純度>99.9%，德國(guó)Merck公司)；乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯(色譜純，純度≥99.9%，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(色譜純，純度>98.0%，阿拉丁)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純?cè)噭Ｋ疄镸illi-Q型超純水儀(美國(guó)，Millipore公司)制備的超純水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 水樣預(yù)處理采集1 L地表水水樣于棕色玻璃瓶中，按照水樣∶甲醇=200∶1的比例在水樣中加入甲醇作為穩(wěn)定劑。水樣運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，用HCl將樣品pH值調(diào)節(jié)為4，置于4 ℃冰箱中避光保存，于48 h內(nèi)進(jìn)行萃取。

1.2.2 固相萃取法將HLB柱與活性炭柱AC串聯(lián)，先后用10 mL二氯甲烷-丙酮(1∶4,V/V)、10 mL 5 mmol/L NH4Ac甲醇溶液和10 mL超純水活化串聯(lián)萃取柱。取500 mL已過(guò)濾水樣，以3 mL/min流量均勻通過(guò)串聯(lián)萃取柱，用10 mL超純水淋洗小柱，氮?dú)饧訅撼檎婵崭稍?0 min。兩柱拆分，用12 mL二氯甲烷-丙酮(1∶4,V/V)分3次洗脫HLB柱，用12 mL 5 mmol/L NH4Ac甲醇溶液分3次洗脫活性炭AC柱。洗脫液混合后，在35 ℃水浴條件下氮吹至近干，以0.1%甲酸水溶液-甲醇(1∶3,V/V)混合溶液定容至1 mL，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為純甲醇，梯度洗脫條件：0～2 min，20%B；2～4.5 min，20%～86%B；4.5～8 min，86%～90%B；8～9 min，90%～20%B；9～11 min，20%B。流速為0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電離方式:電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；離子源溫度：150 ℃;脫溶劑溫度：600 ℃；脫溶劑氣流速：1 000 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在combine模式下通過(guò)質(zhì)譜直接進(jìn)樣，對(duì)目標(biāo)物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)OPs電離形式，選擇各準(zhǔn)分子離子[M+H]+或[M+Na]+作為母離子，對(duì)毛細(xì)管電壓、各母離子的錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)為保證在MRM模式下響應(yīng)值相對(duì)較高且穩(wěn)定。16種OPs的質(zhì)譜條件見表1。

表1 目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為提高目標(biāo)物靈敏度，使色譜峰分離且峰形最佳，實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)不同水相(含0.01%、0.05%、0.1%甲酸水溶液)結(jié)合甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。選擇甲醇的主要原因是本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液均使用甲醇配制，流動(dòng)相有機(jī)溶液與標(biāo)樣溶劑保持一致有利于物質(zhì)的響應(yīng)。結(jié)果顯示隨著水相中甲酸含量的降低，極性大的OPs響應(yīng)有所提高(例如甲胺磷、乙酰甲胺磷等)，極性弱的OPs響應(yīng)值則降低(例如馬拉硫磷、毒死蜱)。綜合考慮多數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)選擇0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。圖1為16種OPs的總離子流色譜圖。

圖1 16種有機(jī)磷農(nóng)藥的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of 16 organophosphorus pesticides

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇OPs極性變化范圍較大(-0.85≤ lgKow≤ 4.96)，在選擇SPE小柱時(shí)需考慮其適用性。目前水中OPs的萃取多采用C18小柱和HLB小柱，但已有研究表明C18小柱和HLB小柱對(duì)強(qiáng)極性O(shè)Ps的富集效率低于40%甚至為0%[13]?；钚蕴緼C小柱是一種富集強(qiáng)極性化合物的萃取柱，曾用于水中OPs強(qiáng)極性化合物的富集[14]。為實(shí)現(xiàn)同時(shí)富集多種極性O(shè)Ps，本實(shí)驗(yàn)比較C18和HLB小柱分別串聯(lián)活性炭AC小柱(串聯(lián)時(shí)AC小柱在下)，萃取OPs時(shí)目標(biāo)物的回收率(圖2、圖3)，得出C18小柱串聯(lián)活性炭AC小柱時(shí)16種OPs回收率在3.25%～104.84%之間，平均回收率為60.72%；HLB小柱串聯(lián)活性炭AC小柱時(shí)16種OPs回收率為19.07%～94.23%，平均回收率為65.52%。為保證多數(shù)目標(biāo)物的萃取效率，最終選擇HLB小柱串聯(lián)活性炭AC小柱。

2.3.2 洗脫液的選擇根據(jù)相似相溶原理，洗脫液必需有足夠的選擇性只將分析物洗脫，而將吸附力強(qiáng)的雜質(zhì)保留在柱上[15]。實(shí)驗(yàn)研究了乙腈、甲醇、二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯5種溶劑的洗脫效果，結(jié)果如圖3所示。對(duì)于強(qiáng)極性的OPs(甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂(lè)果及久效磷)，洗脫效果(平均回收率)為甲醇(68.27%)>乙腈(67.18%)>二氯甲烷(62.49%)>丙酮(50.39%)>乙酸乙酯(35.75%)；對(duì)于其他中等及弱極性的OPs，洗脫效果(平均回收率)為丙酮(81.08%)>乙腈(77.71%)>二氯甲烷(72.58%)>甲醇(65.69%)>乙酸乙酯(63.74%)。單一溶劑均表現(xiàn)出對(duì)中等及弱極性O(shè)Ps回收率較高，對(duì)強(qiáng)極性O(shè)Ps回收率較低。

圖2 不同單一溶劑洗脫串聯(lián)小柱(C18-AC)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Recoveries of organophosphorus pesticides extracted by tandem columns(C18-AC) with different single elution solutions

圖3 不同單一溶劑洗脫串聯(lián)小柱(HLB-AC)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 Recoveries of organophosphorus pesticides extracted by tandem columns(HLB-AC) with different single elution solutions

由于OPs種類較多，極性差異較大，使用單一溶劑洗脫得不到較好的洗脫效果，故考察5種混合溶劑丙酮-二氯甲烷(4∶1)、丙酮-二氯甲烷(1∶1)、乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)、丙酮-乙腈(1∶1)和丙酮-甲醇(3∶7)的洗脫能力，結(jié)果見圖4?？梢?，對(duì)于中等及弱極性的OPs，與單一溶劑相比混合溶劑效果較好，其平均回收率分別為83.47%、82.26%、77.15%、74.03%和63.71%，回收率隨著洗脫溶液極性的增大而減小，在其他的研究中也有類似現(xiàn)象[6,16]。對(duì)于強(qiáng)極性的OPs，其平均回收率分別為64.66%、55.23%、41.55%、64.00%和69.21%，與單一溶劑洗脫效果相差不大。故選擇使用體積比為4∶1的丙酮-二氯甲烷混合溶劑作為HLB小柱的洗脫溶劑。

圖 4 不同混合溶劑洗脫串聯(lián)小柱(HLB-AC)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥回收率的影響Fig.4 Recoveries of organophosphorus pesticides extracted by tandem columns(HLB-AC) with different mixed elution solutions

圖 5 不同溶液洗脫AC小柱對(duì)強(qiáng)極性有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率Fig.5 Recoveries of highly polar organophosphorus pesticides extracted by AC-columns with different elution solutions

因甲醇對(duì)強(qiáng)極性有機(jī)磷農(nóng)藥萃取效果較好，考察4種溶劑5、10、15 mmol/L NH4Ac甲醇溶液及純甲醇對(duì)活性炭AC小柱的洗脫效果，結(jié)果見圖5。洗脫液甲醇中加入NH4Ac后，強(qiáng)極性的OPs回收率明顯提高。但NH4Ac含量達(dá)到15 mmol/L后回收率超出115.00%，與實(shí)際情況不符，可能是大量雜質(zhì)被共洗脫所導(dǎo)致。含5 mmol/L NH4Ac的甲醇平均回收率為102.03%，4種強(qiáng)極性的OPs回收率相對(duì)均衡，故選其為活性炭AC小柱的洗脫液。

2.3.3 其他條件優(yōu)化OPs在堿性條件下易分解，且酸性條件有利于目標(biāo)物與吸附劑的結(jié)合，選擇調(diào)節(jié)水樣pH至4；上樣流速較慢有利于目標(biāo)物富集，故選擇上樣流速為3 mL/min；洗脫液體積采用12 mL，保證能完全將目標(biāo)物洗脫下來(lái)。

2.4 線性范圍及檢出限和定量限

配制濃度梯度為1、3、5、10、25、50、80、100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行分析。檢測(cè)完成后以目標(biāo)物的濃度(x)為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線。結(jié)果顯示，在1～100 μg/L范圍內(nèi)16種OPs線性良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.9912。方法檢出限以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算，定量限以S/N=10計(jì)算，結(jié)果見表2。檢出限為0.004～0.238 ng/L，定量限在0.020～0.794 ng/L之間。

表2 16種有機(jī)磷農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

2.5 加標(biāo)回收率

在500 mL空白水樣中加入OPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為20、100 、200 ng/L，每個(gè)濃度水樣平行5份，按優(yōu)化后條件處理并分析水樣?；厥章始熬芏冉Y(jié)果見表3。平均回收率在55.5%～109.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.0%～13.9%之間，均在允許偏差內(nèi)。

表3 16種有機(jī)磷農(nóng)藥水樣的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

(續(xù)表3)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法測(cè)定了桂林會(huì)仙濕地18個(gè)點(diǎn)位的地表水，除樂(lè)果、滅線磷、殺撲磷和馬拉硫磷外，其余12種OPs均有檢出，含量為0.038～3.280 ng/L，檢出率較高的為毒死蜱(55.5%)>對(duì)硫磷(48.1%)>三唑磷(46.3%)>甲胺磷(42.6%)>敵百蟲(40.7%)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了水中16種有機(jī)磷農(nóng)藥的分析方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，16種目標(biāo)物具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.991，檢出限和定量限范圍分別為0.004～0.238 μg/L和0.020～0.794 μg/L。方法精密度高、重現(xiàn)性好、使用試劑環(huán)境友好，可同時(shí)檢測(cè)多種污染物，滿足水中痕量污染物的分析要求。