楊煥蝶，楊金玉，陳相艷，王易芬，鄭琳琳，陳蕾蕾

(1. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南250014； 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a. 農(nóng)產(chǎn)品研究所，b. 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室,c. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南250100； 3. 山東省濟南生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山東濟南250101)

致瀉性腸桿菌是一類重要的食源性病原菌，是細菌性食物中毒的主要致病菌。腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)于1987年被首次分離自一名患有頑固性腹瀉的智利兒童，是一類新型的致瀉性大腸桿菌[1]。EAEC的形態(tài)與一般大腸桿菌無異，為革蘭氏陰性短桿菌，最適生長溫度為37 ℃，無特殊的營養(yǎng)要求[2]。EAEC不侵入腸道上皮細胞，但能引起腸道液體蓄積，定植于腸道黏膜；不產(chǎn)生熱穩(wěn)定性或熱不穩(wěn)定性腸毒素，也不產(chǎn)生志賀毒素；能分泌腸毒素及細菌毒素，可誘導(dǎo)黏膜炎癥。由于EAEC能對Hep-2細胞形成集聚性黏附，因此也被稱為Hep-2細胞黏附性大腸桿菌[3-5]。EAEC感染是發(fā)展中國家和發(fā)達國家暴發(fā)和非暴發(fā)環(huán)境中腹瀉的重要原因，導(dǎo)致兒童及成人急性或持續(xù)性腹瀉[6-7]。EAEC感染也與沒有腹瀉的兒童營養(yǎng)不良有關(guān)[8]，除了腸產(chǎn)毒性大腸桿菌感染外，EAEC也是旅行者腹瀉的主要原因[9-10]。EAEC以食物和水為主要傳播媒介，通過糞口途徑傳播，人類普遍易感，成年人的中毒癥狀表現(xiàn)為中度腹瀉，嬰幼兒感染后多表現(xiàn)為2周以上的持續(xù)性腹瀉[11-13]。目前，EAEC已在世界范圍內(nèi)由散發(fā)轉(zhuǎn)為暴發(fā)流行。

食源性致病菌引起的食品安全問題嚴重威脅公共衛(wèi)生安全，科學(xué)、快速、準確的食源性病原菌檢測是預(yù)防和控制食源性病原菌引起的食品安全問題的重要手段。食源性病原菌檢測的傳統(tǒng)方法是微生物學(xué)培養(yǎng)鑒定法，操作繁瑣，檢測周期長，特異性不足，靈敏度低。另一種檢測方法是聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法，靈敏度高，特異性強，耗時短，適用范圍廣。PCR技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相比靈敏度更高，特異性更強，實驗耗時更短，與其他新興的檢測技術(shù)相比操作簡單，成本低，因此得到廣泛的應(yīng)用[14-15]。目前在我國國家參考物質(zhì)資源共享平臺上適用于食品微生物檢測的核酸參考物質(zhì)較少，基本停留在由菌種保藏機構(gòu)提供純培養(yǎng)物的階段，因此，針對食源性病原菌聚合酶鏈式反應(yīng)檢測技術(shù)的陽性，對照或定量標準的基因組脫氧核糖核酸(DNA)參考物質(zhì)較為匱乏的這一現(xiàn)象，建立食源性病原菌檢測用核酸參考物質(zhì)的快速制備方法尤為重要。

目前，市場上可供細菌基因組提取的試劑盒多種多樣，但是不同的試劑盒各有特點，適用范圍也各有不同，需要大量制備基因組樣品，并且針對不同菌株的特點進行篩選，甚至是優(yōu)化。本文中通過比較4種細菌基因組提取試劑盒對EAEC基因組DNA的提取效果，并根據(jù)所得基因組DNA的濃度和純度，對其中的2種細菌基因組DNA提取試劑盒進行優(yōu)化，以提高EAEC基因組DNA的濃度和純度，為大量制備EAEC核酸參考物質(zhì)提供高效的提取方法。

1 實驗材料及儀器設(shè)備

1.1 實驗材料

EAEC菌株菌種保藏號為CICC24186，其特征基因引物序列如表1所示，特征毒力基因引物參考國家標準GB 4789.6—2016[5]。

表1 集聚性大腸桿菌(EAEC)特征基因及其引物序列

1.2 試劑與儀器

主要試劑包括：腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Tris-硼酸(TBE)緩沖粉劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖，北京全式金生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，國藥集團；脫氧核糖核酸分子量標記D15000+2000，天根生物技術(shù)有限公司；GelStain核酸染料，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

細菌基因組提取試劑盒為OMEGA細菌基因組提取試劑盒(D3350-01)、天根細菌基因組提取試劑盒(DP302)、全式金細菌基因組提取試劑盒(EE161-01)及寶生物細菌基因組提取試劑盒(9763)。

主要儀器包括：立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；雙人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯(北京)有限公司；Eppendorf離心機，德國埃德本公司；水浴鍋，北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司；制冰機，北京德天佑科技公司；ThermoNanodrop 2000/2000c型超微量紫外分光光度計，賽默飛世爾科技公司；凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

2 實驗方法

2.1 細菌培養(yǎng)

稱取腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基干粉24.5 g，溶于1 L蒸餾水中，分裝后于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后以10 mL/L接種量接種集聚性大腸桿菌，放置于37 ℃的搖床上以轉(zhuǎn)速為180 r/min培養(yǎng)約12 h。

2.2 試劑盒法提取細菌基因組

細菌基因組提取步驟參考試劑盒說明書，提取到的基因組樣品保存溫度為-20 ℃。

2.3 基因組濃度、純度及完整性的檢測

取2 μL基因組樣品與適量的上樣緩沖液混勻后，上樣于含核酸染料GelStain的質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠中，以電壓150 V恒壓電泳35 min，緩沖體系采用TBE緩沖液，電泳結(jié)束后，于凝膠成像儀中分析基因組樣品的完整性和純度。

2.4 集聚性大腸桿菌特征毒力基因的檢測

根據(jù)國家標準GB 4789.6—2016中提供的集聚性大腸桿菌特征毒力基因的引物序列(見表1)合成引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，以集聚性大腸桿菌基因組為模板，克隆其特征毒力基因astA、aggR、pic、uidA，聚合酶鏈式反應(yīng)擴增體系如表2所示，聚合酶鏈式反應(yīng)擴增程序如表3所示。

聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物，點樣于質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠中，以電壓175 V恒壓電泳25 min，緩沖體系采用TBE緩沖液。電泳結(jié)束后，于凝膠成像儀中觀察聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果。

表2 集聚性大腸桿菌特征基因聚合酶鏈反應(yīng)體系

表3 集聚性大腸桿菌特征毒力基因聚合酶鏈式反應(yīng)程序

3 分析與討論

3.1 不同試劑盒對集聚性大腸桿菌基因組的提取效果

分別吸取1 mL培養(yǎng)過夜的集聚性大腸桿菌菌懸液，按照4種細菌基因組提取試劑盒提供的標準方法提取集聚性大腸桿菌基因組，不同試劑盒分別提取的集聚性大腸桿菌基因組純度及濃度見表4?；蚪M質(zhì)量濃度為10.8～30.4 mg/L，其中，天根試劑盒提取的基因組DNA的質(zhì)量濃度最低，只有10.8 mg/L； 寶生物試劑盒提取的質(zhì)量濃度最高，但也僅為30.4 mg/L。純凈的基因組DNA在波長為260 nm處的吸光度A260與波長為280 nm處的吸光度A280的比值為1.8，較純凈的基因組DNA的A260與波長為230 nm處的吸光度A230的比值大于2.0，所提取的基因組DNA的A260/A280的值小于1.66，可能樣品有蛋白質(zhì)污染；A260/A230的值小于1.12，推測基因組DNA樣品可能含有有機試劑或鹽離子等污染物。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。4種試劑盒所提取的基因組條帶完整性良好，無核糖核酸(RNA)污染，但是用4種方法所提取的基因組的濃度均較低。制備核酸標準樣品時前期的基因組樣品提取工作將耗費大量的資源，為提高產(chǎn)率，需要對提取步驟進行必要的優(yōu)化。使用4種試劑盒提取EAEC基因組DNA的提取工作耗時由短到長的順序是寶生物、天根、全式金、OMEGA，其中OMEGA試劑盒提取過程耗時最長，天根試劑盒提取濃度過低。從試劑盒購買價格考慮，OMEGA試劑盒(50次)花費648.00元，而天根試劑盒(50次)花費420.00元；但是該試劑盒需自備RNase A，總費用合計720.00元，在4種試劑盒中價格最高，因此，后續(xù)研究將對寶生物試劑盒及全式金試劑盒標準提取方法進行優(yōu)化。

表4 不同試劑盒提取的集聚性大腸桿菌基因組純度、濃度及價格的比較

M—D15000+2000 DNA Marker；1—3—寶生物試劑盒提取的EAEC基因組；4—6—天根試劑盒提取的EAEC基因組；7—9—全式金試劑盒提取的EAEC基因組；10—12—OMEGA試劑盒提取的EAEC基因組。圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

3.2 寶生物試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

使用寶生物試劑盒標準提取方法中的革蘭氏陽性菌提取方法，并且增加了對于菌懸液的處理過程。取1 mL培養(yǎng)過夜的EAEC菌懸液，離心分離棄上清后加入500 μL的Buffer BS試劑，加入溶菌酶至終質(zhì)量濃度為2 g/L。在第一步的材料處理時加入蛋白酶K后在56 ℃的孵育時間由原來的30 min延長至40 min。

優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的純度及濃度見表5。優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的質(zhì)量濃度為34.1 mg/L，與優(yōu)化前的提取質(zhì)量濃度30.4 mg/L相比，濃度提高較少，提取過程耗時較優(yōu)化前增加了1.5 h，基因組A260/A280及A260/A230的值低于優(yōu)化前的。電泳分析結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，優(yōu)化后提取的基因組條帶清晰，無RNA污染，說明優(yōu)化后提取基因組效果未能達到快速提取大量高質(zhì)量基因組的目的。

表5 優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的集聚性大腸桿菌基因組的純度及濃度

M—天根D15000+2000 DNA Marker；1—4—優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組。圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

3.3 全式金試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

采用全式金細菌基因組DNA試劑盒標準提取方法中革蘭氏陽性菌提取方法進行集聚性大腸桿菌基因組的提取，并對提取方法改進。

第一步材料處理。在菌液的重懸液中加入200 μL RB11試劑(含溶菌酶4 mg)后在37 ℃的孵育時間由原來的1 h改為40 min，加入蛋白酶K后在55 ℃的孵育時間由原來的15 min延長至30 min，洗脫后測定收集到溶菌酶裂解處理后的基因組DNA樣品的純度及濃度，見表6。由表可以看出，經(jīng)溶菌酶孵育處理后EAEC基因組DNA的提取量增大了近3倍。電泳分析結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，所提取的基因組條帶均一，無RNA污染。在提取過程中，加入試劑LB11與蛋白酶K經(jīng)55 ℃孵育30 min后，菌液仍非常黏稠，因此推測EAEC菌體細胞成分較為復(fù)雜，可能是蛋白質(zhì)含量較高，加入的蛋白酶K未能完全消化菌體蛋白，導(dǎo)致裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)基因組DNA的提取，后續(xù)實驗提高蛋白酶K的用量至40 mg/L。

表6 溶菌酶裂解處理后集聚性大腸桿菌基因組提取的純度和濃度

EAEC—集聚性大腸桿菌；M—D15000+2000 DNA Marker；1—3—溶菌酶裂解后提取的EAEC基因組。圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析溶菌酶裂解處理后的集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

增大蛋白酶K的用量后，菌體裂解液黏稠度明顯降低，將其轉(zhuǎn)移到吸附離心柱中離心后，液體易于通過吸附膜，因此，為了提高基因組的濃度，取3倍體積菌體裂解液用于提取基因組。表7為提高蛋白酶K用量后提取集聚性大腸桿菌基因組的純度和濃度。由表可知，采用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取方法并增大1倍蛋白酶K的用量后，集聚性大腸桿菌基因組的濃度達到了197.7 mg/L，較標準方法提取的基因組的濃度增大了約14.5倍，但基因組純度沒有提高，推測所提取的基因組中仍有蛋白質(zhì)等碳水化合物或無機鹽、有機試劑的污染。由于所提取的基因組DNA用于制備定性核酸標準樣品，因此模板DNA的純度對聚合酶鏈式反應(yīng)擴增基因組的特征基因影響較小。瓊脂糖凝膠電泳分析提高蛋白酶用量后的腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，所提取的EAEC基因組條帶明顯，未見降解，無RNA污染，表明該優(yōu)化方法能有效提高基因組DNA的濃度。

表7 提高蛋白酶K用量后提取集聚性大腸桿菌基因組的純度和濃度

EAEC—集聚性大腸桿菌；M—天根D15000+2000 Marker；1—4—EAEC基因組。圖4 瓊脂糖凝膠電泳分析提高蛋白酶用量后的腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

3.4 集聚性大腸桿菌毒力基因PCR擴增檢測

根據(jù)國家標準GB4789.6—2016的方法，對所提取的集聚性大腸桿菌基因組進行檢測。以所提取的集聚性大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增其特征基因astA、aggR、pic和uidA，并對其擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖5所示。

astA、aggR、pic基因為集聚性大腸桿菌的特征毒力基因，uidA基因可在97%的大腸桿菌內(nèi)檢測到，4個基因的檢測結(jié)果均為陽性，PCR產(chǎn)物條帶大小與目的片段大小相符，說明所提取的基因組確為集聚性大腸桿菌基因組。盡管所提取基因組的純度指標A260/A280和A260/A230均未達到1.8，但是根據(jù)毒力基因擴增結(jié)果可知，所制備的基因組樣品對于定性核酸標準樣品的檢測結(jié)果無影響，可用于制備定性核酸標準樣品。

M—全式金D2000+200 bp Marker; 1為astA(102 bp); 2—aggR(400 bp);3—pic (1 111 bp); 4為uidA(1 487 bp)。圖5 瓊脂糖凝膠電泳檢測集聚性大腸桿菌(EAEC)的特征毒力基因

4 結(jié)論

對比使用多種細菌基因組DNA提取試劑盒提取EAEC基因組的提取效果可知，由于EAEC細胞裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)的基因組提取，因此提取到的EAEC基因組的濃度及純度均非常低。4種試劑盒中全式金試劑盒提取步驟簡便，耗時少，因此對該試劑盒提取過程進行優(yōu)化。通過增加30 min的溶菌酶孵育、1倍蛋白酶K的用量及2倍體積的菌體裂解液，EAEC基因組的提取濃度提高了14.5倍，以所提取的基因組為模板，PCR檢測EAEC的特征毒力基因，結(jié)果顯示3個特征毒力基因均為陽性，滿足用于制備食品檢測用核酸定性參考物質(zhì)的要求。本文中的研究為大量提取核酸定性標準樣品的前期樣品奠定了基礎(chǔ)，同時也為探索基因組提取困難的細菌基因組的提取方法提供了參考。