韓方方， 張紅壘， 丁慶文， 劉紅亮， 張燕， 魏戰(zhàn)勇

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

豬偽狂犬病(Pseudorabies)屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，水痘病毒屬。是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 引起的多種家畜以發(fā)熱、奇癢(豬除外)、繁殖障礙、腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為 B 類動物疫病，中國將其列為二類動物疫病[1]?，F(xiàn)在已有40多個國家報道40多種動物感染該病,其中豬最容易感染，是其唯一的天然宿主及最主要的傳染源[2]。妊娠母豬感染PRV后可產(chǎn)死胎及木乃伊胎，引起流產(chǎn)，新生仔豬主要表現(xiàn)為腹瀉、衰竭和嚴重神經(jīng)癥狀，其死亡率可達到100%[2-4]。PR在世界各國分布廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)造成的損失極為重大。PRV于1974年傳入中國，至今在全國已經(jīng)有30多個省份流行，是嚴重危害中國養(yǎng)豬業(yè)重要疫病之一。目前，對PRV分離株的致病性研究大多采用較大日齡的豬，而對仔豬的致病性研究及其在仔豬體內(nèi)的分布情況報道較少[3-5]。有研究報道PRV能夠引起100日齡豬的腦、肝臟和肺臟產(chǎn)生明顯的組織病理變化，且在相應(yīng)組織中有較高的拷貝數(shù)[6]。而PRV是否感染豬的腸道組織報道較少。本試驗通過對河南省新鄭某規(guī)?；i場3只疑似為PRV感染病死仔豬進行病原的PCR檢測及組織分布檢測，并對其gE部分基因進行測序，與國內(nèi)外其他參考毒株進行了序列比對分析，旨在為了解PRV在自然感染仔豬體內(nèi)的分布情況、弄清近年來PRV的來源及與其他毒株的親緣關(guān)系提供參考，以期為河南地區(qū) PRV 的診斷和防控提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

河南省新鄭某規(guī)?；i場2018年11月份有2窩仔豬突然出現(xiàn)體溫升高、身體發(fā)顫、嘔吐及頭轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀，仔豬發(fā)病2 d后逐漸出現(xiàn)死亡，死亡率80%。發(fā)病送檢的3只疑似為自然感染PRV發(fā)病死亡4日齡仔豬，發(fā)病仔豬3日齡表現(xiàn)為高熱、拉稀、嘔吐、共濟失調(diào)、后驅(qū)癱瘓等急性癥狀。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)液(武漢博士德生物公司)，DNA提取酚試劑(北京索萊寶公司)，DPEC水、氯仿、異丙醇(康為世紀公司)，TransZol試劑(全氏金生物公司)，75%乙醇(恩碩公司)，2×Taq Master MiX、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生物工程公司)，DNA Marker DL2000、MarkerⅠ，瓊脂糖(Promega公司)，膠回收試劑盒(OMEGA公司)。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上已經(jīng)登錄的豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritis of swine TGEV)、豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)的基因組序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0基因分析軟件分別設(shè)計了5對特異性檢測引物和1對PRV的gE基因特異性擴增引物，引物送至鄭州擎科生物科技公司合成。相關(guān)引物序列信息見表1。

1.4 病原的檢測

1.4.1 病料的采集與處理 首先需對病死仔豬進行病原檢測，取其肝、脾、腦組織和腸系膜淋巴結(jié)適量混合研磨，移入適量DMEM培養(yǎng)液混合制成組織勻漿，用微量加樣器將混合組織勻漿移入干凈的EP管內(nèi)，12 000 r·min-1離心10 min(Eppendorf 4 ℃離心機)。然后取上清液并分裝放入-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后進行該病死仔豬各組織器官內(nèi)病毒的分布檢測，分別取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、大腸、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腦組織，處理方法及保存同上。

表1 相關(guān)引物序列信息Table 1 Relevant primer sequence information

1.4.2 DNA提取及PRV的檢測 采取SDS-Protein K法提取混合組織樣品DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉腄NA作為模板，用PRV檢測引物T1/T2進行PRV的檢測，PCR擴增體系見表2，擴增程序見表3。取6 μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下判斷結(jié)果。

表2 PCR擴增體系

表3 PCR擴增程序Table 3 Programming of PCR amplification

1.4.3 RNA的提取及PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV的檢測 用Trizol試劑提取混合組織樣品RNA，按照Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，操作方法為：向EP管中加入Oligo(dT)23VN 1 μL，Total RNA 7 μL，在65 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)加熱5 min，然后迅速放在冰上靜置2 min；加入 HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL ，2×RT Mix 10 μL，用微量加樣器輕輕地吹打混勻，然后用封口膜封住EP管口，保證密封；反應(yīng)程序設(shè)置50 ℃，45 min；85 ℃，2 min；獲得產(chǎn)物cDNA可立即用于進行PCR反應(yīng)或放置在-40 ℃冰箱保存。

以上述方法得到的cDNA為模板進行PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV的檢測，PCR擴增體系同及擴增程序同表2、表3。根據(jù)PEDV引物T3/T4、TGEV引物T5/T6、PDCoV引物T7/T8、PRRSV引物T9/T10需要的退火溫度不同，分別為58、54、56和53 ℃，由此，需將表3中退火溫度設(shè)定為53～58 ℃的退火溫度梯度。取6 μL PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中拍照判斷結(jié)果。

1.5 病原的各組織分布檢測

以1.4.2同樣的方法提取所采集的各組織器官的DNA作為模板，用PRV檢測引物T1/T2進行PRV于各組織器官的分布檢測，PCR擴增體系及擴增程序同表2、表3。同時設(shè)置2個對照組，以保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 組織病理學(xué)檢測

采集發(fā)病仔豬和正常仔豬的新鮮心臟，肝臟，脾臟，肺臟和腎臟組織，迅速固定，經(jīng)脫水透明、浸蠟和包埋，制作組織切片，用蘇木素-伊紅法(HE)染色后，置于XD-202倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)下觀察。

1.7 gE基因的擴增與鑒定

以混合組織樣品DNA為模板用PRVgE基因擴增引物P1/P2進行PRVgE基因的擴增，PCR擴增體系及擴增程序同表2、表3，將表3中退火溫度設(shè)定為58 ℃。 PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段經(jīng)膠回收后送至鄭州擎科生物科技有限公司進行測序鑒定。

1.8 gE基因序列分析

用DNAStar7.1中的MegAlign軟件對測序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的20條國內(nèi)外PRV參考毒株gE基因的序列進行核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析，并繪制遺傳進化樹。參考毒株信息見表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的檢測結(jié)果

以提取的混合組織樣品DNA和cDNA為模板，分別用PRV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV 5種病毒的特異性檢測引物進行PCR擴增，結(jié)果見圖1。只有PRV擴增出l條清晰條帶，大小與預(yù)期的273 bp結(jié)果相符，其余4種病毒均未擴增出條帶。初步結(jié)果表明，3頭仔豬均感染豬偽狂犬病病毒。

表4 參考毒株信息

2.2 病原的各組織分布結(jié)果

以提取的仔豬各組織器官DNA為模板，用PRV檢測引物T1/T2進行擴增，將心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、大腸、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腦組織的PCR產(chǎn)物分別加入用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，該發(fā)病仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)、腦組織和陽性對照均出現(xiàn)與PRVgE基因一致的大小為273 bp的片段，顯示為PRV陽性；腎臟、小腸、大腸、腹股溝淋巴結(jié)和陰性對照無目的片段。說明PRV在該自然感染仔豬體內(nèi)具有比較廣泛的組織嗜性。

M:DL2000 Marker; 1～5:PRV、PDEV、TGEV、PDCoV、PRRSV 5種PCR產(chǎn)物;N:陰性對照。

M:Marker Ⅰ;1 ～10: 心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、大腸、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腦組織的PCR產(chǎn)物;N:陰性對照;P：陽性對照。M: Marker Ⅰ;1 to 10: PCR products of heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine, large intestine, mesenteric lymph node, inguinal lymph node and brain tissue; N: Negative control; P: Positive control.圖2 PRV在仔豬各組織的分布

2.3 組織病理學(xué)檢測結(jié)果

對采集的發(fā)病仔豬和正常仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織經(jīng)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，自然感染PRV組的心臟，肺臟和腎臟組織沒有明顯的組織病理學(xué)變化，而肝臟、脾臟組織炎性細胞顯著增多(圖3)。

圖3 PRV自然感染仔豬的組織病理學(xué)變化

2.4 gE基因擴增與鑒定結(jié)果

將組織樣品DNA進行PRVgE基因的PCR擴增，結(jié)束后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到約430 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)。目的片段經(jīng)膠回收后由鄭州擎科生物科技公司進行測序鑒定。測序結(jié)果顯示，該基因片段的大小為383 bp，編碼128個氨基酸，說明該發(fā)病仔豬為PRV野毒感染。

M:DL2000 Marker;1:PRV gE基因PCR產(chǎn)物。

2.5 gE基因序列分析結(jié)果

為便于將所測的gE基因序列與GenBank中已發(fā)表的 PRV 毒株的基因序列進行同源性比較分析，將檢測到的 PRV 命名為PRV HNZZ01。將測序的結(jié)果與GenBank中已經(jīng)登錄的其它20株P(guān)RVgE基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析比對，結(jié)果顯示，PRV HNZZ01的gE部分基因序列和參考毒株的核苷酸序列的同源性在98.2%～99.5%。其中與國內(nèi)Ea、GDSH、Guizhou-DY、HBCL-2012、LXB6、SC、Xiang A株和韓國Yangsan株的同源性最高為99.5%,與國內(nèi)Guangdong株的同源性最低為98.2%，與歐美國家Becker、Kaplan、Nia-A、Rice等經(jīng)典毒株的同源性相對比較低，為98.7%～99.2%。核苷酸的多序列比對結(jié)果表明，不同株之間gE基因的核苷酸序列中存在許多堿基的替換，主要在G-A和T-C之間。PRV HNZZ01株gE部分基因核苷酸序列在314位和383位出現(xiàn)了明顯的堿基突變，314位由G→A，383位由C→T(圖5)。

PRV HNZZ01gE部分基因序列和參考毒株推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性在97.6%～100%,其中與國內(nèi)Ea、GDSH、Guizhou-DY、HBCL-2012、LXB6、SC、Xiang A株和馬來西亞P-Prv株、韓國Yangsan株的同源性最高為100%,與國內(nèi)Guangdong株的同源性最低為97.6%，與歐美國家Becker、Kaplan、Nia-3、Rice等經(jīng)典毒株同源性相比較低，為98.4%～99.2%。推導(dǎo)的氨基酸多序列比對的結(jié)果顯示，歐美Becker、Kaplan、Nia-3、Rice等經(jīng)典毒株與國內(nèi)毒株編碼的氨基酸序列相比，第8位由亮氨酸(L)變?yōu)榻z氨酸(S)(圖6)；PRV HNZZ01gE基因編碼的氨基酸序列在第128位由絲氨酸(S)變?yōu)楸奖彼?F)(圖7)。

圖6 PRV HNZZ01與參考毒株gE部分基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對

圖7 PRV HNZZ01與參考毒株gE部分基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對

在PRV HNZZ01和GenBank中已登錄的20株P(guān)RV參考株gE基因部分核苷酸相似性基礎(chǔ)上做了遺傳進化樹的分析(圖8)。結(jié)果顯示，gE基因的遺傳進化樹明顯分成了2個大群。其中，中國、馬來西亞和韓國處于一個大的亞群，組成一個亞洲株進化群；歐洲和美洲的毒株處于另一個大的亞群，組成一個歐美株進化群。PRV HNZZ01株處于亞洲毒株進化群;并且與國內(nèi)經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系較近，與國外毒株的親緣關(guān)系較遠。

圖8 PRV HNZZ01 gE基因的遺傳進化樹分析Fig.8 Genetic and evolutional tree analysis of gE gene of HNZZ01

3 討論

2012年以來，中國許多地方偽狂犬病疫情日益嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的影響。并且許多地區(qū)分離得到新的PRV變異毒株，變異株的毒力明顯增強[6-10]。這表明，PRV毒株正在往新的高致病力方向進化。有研究表明，當(dāng)前生產(chǎn)上使用的弱毒疫苗接種后不能對豬群提供有效的保護，無法幫助豬群抵御新流行毒株的攻擊[11-13]。PRV的gE糖蛋白雖然不是病毒復(fù)制的必須蛋白，但該蛋白缺失后能極大減弱病毒的毒力[14]。近年來,gE基因的變異成為中國PRV新流行株的分子特征之一[15-16]，所以選擇對gE基因序列進行比對分析。

本研究采用普通PCR抗原檢測方法及gE部分基因擴增和序列分析等方法，檢測證實該病死仔豬感染PRV野毒。并對該病死仔豬進行PRV各組織器官定性分布檢測，結(jié)果顯示，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)和腦組織中均檢測到了PRV，這與龍曉婷等[17]、郭麗靜等[18]的研究結(jié)果大致相一致，不同之處是他們采用的是人工攻毒30日齡的豬，且能夠引起腎臟顯著的病理變化，而本研究在腎臟組織沒有檢測到病原的存在，研究結(jié)果進一步說明PRV在該自然感染仔豬體內(nèi)分布較廣，具有比較廣泛的組織嗜性。

將PRV HNZZ01與其他20株參考毒株gE部分基因序列比較分析，結(jié)果顯示，gE基因核苷酸序列在314位和383位出現(xiàn)了明顯的堿基突變，314位由G→A，383位由C→T，同時編碼的氨基酸序列與參考毒株相比在第128位由絲氨酸(S)變?yōu)楸奖彼?F)。以上表明該毒株可能是gE基因序列中個別氨基酸位點發(fā)生了突變，使PRV病毒抗原發(fā)生了變異，從而使PRV毒力增強，以致現(xiàn)有的疫苗不能夠發(fā)揮理想的免疫保護作用，這也許是引起當(dāng)前PRV疫情流行的主要原因。該突變對PRV的毒力強度及是否會影響中和抗體的產(chǎn)生有待進一步的研究。遺傳進化樹分析的結(jié)果顯示，PRV HNZZ01與國內(nèi)Ea、GDSH、Guizhou-DY、SC等經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系最近，與歐美毒株的親緣關(guān)系最遠，說明檢測的PRV HNZZ01應(yīng)該來源于國內(nèi)經(jīng)典毒株，但部分基因發(fā)生了變異。

綜上所述，PRV在該自然感染仔豬體內(nèi)具有比較廣泛的組織嗜性，PRV HNZZ01應(yīng)該屬于變異毒株，其分子特征可為河南地區(qū)變異株的分子流行病學(xué)的調(diào)查提供重要參考，以便更好地對豬偽狂犬病的防控提供科學(xué)依據(jù)。