李廣偉，楊春曉，于 杰，劉 盛，張卓睿*

（1.山東濰坊科技學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，山東 濰坊 261000；2.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013）

藍(lán)莓（Semen trigonellae）是杜鵑花科越橘屬植物[1]，屬多年生灌木小漿果果樹(shù)，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含維生素A（vitamin A，VA）[2]、維生素E（vitamin E，VE）[3]、花青素[4]、酚酸[3]、熊果酸[3]、類(lèi)黃酮[3]和超氧化物歧化酶[5]等天然活性成分，具有改善視力[6]、抗氧化[7]、增強(qiáng)免疫力[8]、抑菌[9]和保護(hù)心腦血管[10-11]等功效，是聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）推薦的五大營(yíng)養(yǎng)健康水果之一，被譽(yù)為“漿果之王”[2-4]。酸櫻桃（Cerasus valgarisMill.）是薔薇科李屬經(jīng)濟(jì)樹(shù)木[12]，其果實(shí)為核果，含有多糖、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是原花青素[13]、花色苷[14]、褪黑激素[15]、槲皮素[12]等功效成分含量較高，具有清除自由基[14]、抗癌[12]、改善睡眠[16]、降低血糖[17]等藥理作用。

果酒是將破碎、壓榨后的水果經(jīng)發(fā)酵等工藝制成的一類(lèi)飲料酒，酒精度低，一般為7%vol～18%vol[18-19]。果酒中富含氨基酸、維生素、多糖、多酚等多種活性成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，可起到控制人體內(nèi)膽固醇和促進(jìn)血液循環(huán)、預(yù)防心腦血管疾病，調(diào)節(jié)新陳代謝，抗衰老等功效[20]。近幾年，果酒需求量逐年增大，研制果酒新品種成為食品研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[21]。

目前已有利用藍(lán)莓釀制果酒的相關(guān)報(bào)道。劉彩婷[22]通過(guò)對(duì)比18種商業(yè)酵母的發(fā)酵過(guò)程，篩選出了最適宜藍(lán)莓酒的JK10酵母，并確定了藍(lán)莓酒的最佳發(fā)酵工藝條件。胡佳星等[23]對(duì)野生藍(lán)莓果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并采用最佳發(fā)酵工藝條件制備果酒的酒精度為4.2%vol，感官評(píng)分為87分。李安等[24]研究了發(fā)酵及貯藏條件對(duì)藍(lán)莓果酒中花色苷的影響。關(guān)于櫻桃果酒方面的研究也較多。李志友等[25]對(duì)櫻桃果酒的釀造工藝進(jìn)行了優(yōu)化，采用最佳的工藝條件所得櫻桃果酒口味醇正，酒精度為10%vol～11%vol。雷丹等[26]通過(guò)試驗(yàn)研究，制得了酒精度為10.8%vol、口感較好的川西高原野櫻桃果酒。張秀艷等[27]改良了釀造工藝，使得櫻桃果酒的理化指標(biāo)和感官指標(biāo)有了較大提高。彭璐等[28]篩選出的產(chǎn)香酵母，能使櫻桃酒增加20種香氣成分。

基于藍(lán)莓和酸櫻桃的營(yíng)養(yǎng)特色，本研究以藍(lán)莓、酸櫻桃為原料制備藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒，以初始糖度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為自變量，以酒精度為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝條件，以期豐富果酒的產(chǎn)品種類(lèi)，增加兩種水果的應(yīng)用途徑，提高食用附加值，克服其供應(yīng)季短、不耐運(yùn)輸和貯藏的局限性，為推進(jìn)兩種水果的種植業(yè)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸櫻桃：采于吉林省蛟河試驗(yàn)林場(chǎng)，預(yù)冷（-20 ℃預(yù)冷24 h）后放入冰箱內(nèi)冷凍（-80 ℃）貯藏；藍(lán)莓：采于吉林省臨江藍(lán)莓基地，預(yù)冷（-20 ℃預(yù)冷24 h）后放入冰箱內(nèi)冷凍（-80 ℃）貯藏。

1.1.2 試劑

安琪果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（優(yōu)級(jí)純）：市售；亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-2500S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市科技儀器有限公司；LDZX-40 Ⅱ型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；FA2004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；精密酒精計(jì)：河間市振巖儀器儀表廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

藍(lán)莓、酸櫻桃的預(yù)處理：去除藍(lán)莓果和酸櫻桃果中的雜質(zhì)，以及一些有病蟲(chóng)害和霉?fàn)€的壞果，將挑選出來(lái)的果實(shí)沖洗干凈，瀝去水分，酸櫻桃去核。

混合、破碎：將藍(lán)莓與去核后的酸櫻桃按配比1∶1（g∶g）混合，充分破碎、攪拌，使兩種果漿能均勻的混合在一起。

成分調(diào)整、滅菌：按照試驗(yàn)所確定的添加量，向混合果漿中加入23%蔗糖，同時(shí)，為了起到殺菌作用，按混合果漿總量的0.04%加入NaHSO3，在60～65 ℃條件下巴氏殺菌25～30 min。

酵母活化：將安琪果酒酵母按料液比1∶10（g∶mL）加入到2%蔗糖溶液中，在35 ℃條件下活化30 min[29]。

發(fā)酵：將活化好的果酒酵母按0.06%接種量接種到滅菌后的藍(lán)莓、酸櫻桃復(fù)合果漿中，攪拌均勻后，在22 ℃條件下發(fā)酵13 d，每隔24 h檢測(cè)一次發(fā)酵液的初始糖度，當(dāng)初始糖度降至6%以下時(shí)，停止發(fā)酵。

酒渣分離和后發(fā)酵：將發(fā)酵好的藍(lán)莓-酸櫻桃酒液用濾布過(guò)濾，過(guò)濾出的酒液在18 ℃條件下后發(fā)酵20 d，然后倒罐、分離酒腳。

陳釀、成品：在17～18 ℃條件下陳釀70～80 d，期間進(jìn)行倒罐、下腳澄清等處理，陳釀后的酒液用300目濾布過(guò)濾，即得藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒成品。

1.3.2 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用單因素輪換法，以酒精度和感官得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察藍(lán)莓與酸櫻桃的質(zhì)量比（4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4（g∶g））、初始初始糖度（17%、19%、21%、23%、25%）、酵母接種量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發(fā)酵溫度（18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）對(duì)藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的影響。

1.3.3 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）和初始糖度（C）為試驗(yàn)因素，以酒精度（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of blueberry-sour cherry compound fruit wine

1.3.4 分析檢測(cè)

酒精度、總糖、總酸的測(cè)定采用國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法、直接滴定法及電位滴定法[30]；糖度的測(cè)定采用折光計(jì)法[31]。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

參照國(guó)標(biāo)GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》中感官評(píng)分要求[32]，結(jié)合藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的特點(diǎn)，請(qǐng)10位專(zhuān)業(yè)人員從色澤、氣味、口感和狀態(tài)四個(gè)方面對(duì)復(fù)合果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，滿(mǎn)分為100分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of blueberry-sour cherry compound fruit wine

續(xù)表

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 藍(lán)莓與酸櫻桃最佳配比的確定

由表3可知，在藍(lán)莓和酸櫻桃質(zhì)量比為4∶1～1∶4的范圍內(nèi)，各樣品的酒精度在（9.1±0.14）%vol～（9.7±0.12）%vol之間，相差不大，說(shuō)明藍(lán)莓和酸櫻桃不同配比對(duì)復(fù)合果酒的酒精度有一定的影響，但影響效果不顯著。當(dāng)藍(lán)莓和酸櫻桃質(zhì)量比在4∶1～1∶2時(shí)，酒精度呈增加趨勢(shì)，由于釀酒酵母適宜在pH 4左右的酸性環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，而酸櫻桃中有機(jī)酸含量較高，所以隨著其添加量的增加，復(fù)合果酒的酒精度逐漸增大；當(dāng)藍(lán)莓：酸櫻桃的質(zhì)量比為1∶2時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為（9.7±0.12）%vol；之后再繼續(xù)增加酸櫻桃的添加量，酒精度降低至（9.5±0.13）%vol，究其原因可能是，加入過(guò)量的酸櫻桃會(huì)使復(fù)合果酒酸度低于適宜的范圍，不利于酵母發(fā)酵。通過(guò)感官評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)兩種水果的不同質(zhì)量比，對(duì)復(fù)合果酒的口感影響較大，當(dāng)藍(lán)莓酸櫻桃質(zhì)量比超過(guò)1∶1時(shí)，復(fù)合果酒過(guò)酸，品嘗起來(lái)有明顯的刺口、尖銳感，口感變差。因此，綜合考慮復(fù)合果酒的酒精度和感官評(píng)價(jià)，確定藍(lán)莓和酸櫻桃的適宜質(zhì)量比為1∶1，此時(shí)復(fù)合果酒的酒精度為（9.6±0.10）%vol，感官評(píng)分為（79.8±0.17）分。

表3 藍(lán)莓和酸櫻桃質(zhì)量比對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 3 Effect of mass ratio of blueberry and sour cherry on compound fruit wine quality

2.1.2 初始糖度的確定

由表4可知，隨著復(fù)合果汁中初始糖度在17%～23%范圍內(nèi)的增加，復(fù)合果酒的酒精度逐漸增大，當(dāng)初始糖度為23%時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為（10.6±0.12）%vol，此時(shí)復(fù)合果酒酸甜適口，具有明顯的果香和酒香，香氣協(xié)調(diào)，感官品質(zhì)最好，感官評(píng)分為（78.1±0.21）分；之后初始糖度增加至25%時(shí)，酒精度有所下降。這是因?yàn)闈B透壓增高而抑制了酵母的活性，導(dǎo)致發(fā)酵出現(xiàn)延滯，而且，由于發(fā)酵后的酒液中殘余糖分過(guò)高，復(fù)合果酒的口感偏甜，感官品質(zhì)下降，評(píng)分降至（74.2±0.16）分。因此，確定藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的適宜初始糖度為23%。

表4 初始糖度對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 4 Effect of initial sugar content on compound fruit wine quality

2.1.3 酵母接種量的確定

由表5可知，隨著復(fù)合果酒酵母添加量在0.04%～0.06%范圍內(nèi)的增加，酒精度急劇增大，這是因?yàn)楣刑欠帜艹浞洲D(zhuǎn)化為酒精，當(dāng)復(fù)合果酒酵母添加量為0.06%時(shí)，酒精度達(dá)到最大值（10.7±0.31）%vol，此時(shí)所得復(fù)合果酒呈寶石紅色，酸甜適口，果香和酒香協(xié)調(diào)，感官評(píng)分最高為（77.8±0.21）分，之后再繼續(xù)增加果酒酵母添加量至0.12%，酒精度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)檩^多的糖分用于了微生物的生長(zhǎng)繁殖，且易導(dǎo)致酵母細(xì)胞的過(guò)早老化、自溶等[33]，不利于發(fā)酵。由感官評(píng)分可知，酵母添加量過(guò)高，會(huì)使藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的口感偏酸澀，甚至?xí)a(chǎn)生苦味，感官評(píng)分逐漸降低。因此，確定藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒適宜酵母接種量為0.06%。

表5 酵母接種量對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 5 Effect of yeast inoculum on compound fruit wine quality

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

環(huán)境溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響果酒酵母的酶活性。由表6可知，隨著發(fā)酵溫度在18～24 ℃范圍內(nèi)的增加，酒精度呈上升趨勢(shì)；在發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí)，復(fù)合果酒的酒精度和感官評(píng)分最高，分別為（11.8±0.21）%vol、（78.5±0.42）分，果酒呈寶石紅色，果味和酒香協(xié)調(diào)，口感清爽，后味甘甜；當(dāng)發(fā)酵溫度高于24 ℃時(shí)，酒精度有所下降。通過(guò)對(duì)各試驗(yàn)組的感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的發(fā)酵溫度不適宜超過(guò)24 ℃，否則酒體會(huì)產(chǎn)生苦澀味，顏色變淡，同時(shí)果香也逐漸不明顯，感官品質(zhì)下降。因此，確定藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

表6 發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 6 Effect of fermentation temperature on compound fruit wine quality

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間的確定

由表7可知，在藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間7～13 d是釀酒酵母生成酒精的旺盛時(shí)期，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為13 d時(shí)，藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的酒精度為（13.1±0.33）%vol，其香氣和諧，酒味醇厚，風(fēng)味較好，感官評(píng)分為（81.4±0.27）分，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵天數(shù)至15 d，酒精度和感官評(píng)分略有下降。為了提高生產(chǎn)效率，確定藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的適宜發(fā)酵時(shí)間為13 d。

表7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 7 Effect of fermentation time on compound fruit wine quality

2.2 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）和初始糖度（C）為自變量，以酒精度（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表8，方差分析結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of blueberry-sour cherry compound fruit wine

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的酒精度（Y）對(duì)發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）和初始糖度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由表9可知，所得回歸模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.586 0＞0.05），說(shuō)明該模型擬合度良好，回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用此方程代替真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，誤差較??；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＝0.68%＜1%，表明各試驗(yàn)結(jié)果的精密度高，結(jié)果真實(shí)可靠[34]；決定系數(shù)R2=0.994 5，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.987 4，表明方程擬合度高[35]。因此，可利用該模型分析和預(yù)測(cè)藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝條件。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（A）、初始糖度（C）交互作用對(duì)酒精度影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 各因素交互作用對(duì)酒精度影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig. 1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content

根據(jù)各因素間的三維響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖判定各因素間交互作用的強(qiáng)弱，反映兩因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響大小。響應(yīng)面圖曲面坡度幅度代表響應(yīng)值的變化幅度，曲面坡度越陡，對(duì)響應(yīng)值的影響越大，反之，則越小。由圖1可知，各因素交互作用的響應(yīng)面曲線(xiàn)都出現(xiàn)了極大值，說(shuō)明3個(gè)試驗(yàn)因素所選擇的水平范圍合理，能反映出對(duì)酒精度的影響趨勢(shì)。結(jié)合方差分析可知，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度交互作用極顯著（P=0.001 1＜0.01），發(fā)酵溫度與初始糖度交互作用極顯著（P=0.009 1＜0.01），兩種交互作用的響應(yīng)曲面都比較陡峭，對(duì)復(fù)合果酒酒精度具有極顯著的影響；發(fā)酵時(shí)間與初始糖度交互作用顯著（P=0.0490＜0.05），說(shuō)明該交互作用雖然對(duì)酒精度有影響，但影響程度要低于前面兩種交互作用。

2.2.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間12.62 d，發(fā)酵溫度22.22 ℃，初始糖度22.67%，軟件預(yù)測(cè)的酒精度值為13.3%vol，為方便實(shí)際操作，將優(yōu)化條件修正為發(fā)酵時(shí)間13 d，發(fā)酵溫度22 ℃，初始糖度23%，按照修正后的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的酒精度實(shí)際平均值為（13.4±0.11）%vol，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相差不大，表明該工藝可行。

2.2.4 藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

通過(guò)此工藝參數(shù)所得藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒酒體澄清透明，口感香醇，酒精度為（13.4±0.11）%vol，總糖（以葡萄糖計(jì)）含量為3.7 g/L，總酸（以乙酸計(jì)）含量為6.5 g/L，符合國(guó)標(biāo)GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》要求。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到藍(lán)莓-酸櫻桃復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝條件為藍(lán)莓和酸櫻桃的質(zhì)量比1∶1，酵母接種量0.06%，初始糖度23%，發(fā)酵時(shí)間13 d，發(fā)酵溫度22 ℃，在此優(yōu)化條件下，所得果酒酒精度實(shí)際值為（13.4±0.11）%vol，酒體呈寶石紅色，澄清透明，口感醇厚，總糖（以葡萄糖計(jì)）含量為3.7 g/L，總酸（以乙酸計(jì)）含量為6.5 g/L，符合國(guó)標(biāo)GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》要求。