曹 菁，張雪元*，周 彬，王 晨，郝江偉

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435000；2.中藥保健食品與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶 435100）

多糖廣泛存在于植物中，它是構(gòu)成生物生命活動(dòng)的最重要的基本物質(zhì)之一。茯苓（Poria cocos）為多孔菌科真菌的干燥菌核，多糖是茯苓的主要活性成分，約占其菌核干質(zhì)量的70%～90%[1-4]，現(xiàn)代研究表明茯苓多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化等生物活性[5-8]。白芷（Angelica dahurica）為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其中多糖含量達(dá)34.14%[1，9]。白芷多糖具有體外抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、調(diào)節(jié)免疫力功效[9-12]。白扁豆（Dolichos lablab）為豆科植物扁豆的干燥成熟種子，主要成分是多糖，含量為50%左右[1，13]。白扁豆多糖具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[14-16]。

茯苓多糖主要存在細(xì)胞壁中，常見(jiàn)溶劑提取法包括水提法和堿提法，其中以水為溶劑，操作安全、無(wú)毒[17-18]。屈賀冪[19]研究了茯苓多糖水提工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳浸提工藝參數(shù)為浸提溫度90 ℃，浸提時(shí)間7.4 h，水料比9.4倍，在此條件下，茯苓多糖得率為0.758%。目前，白芷多糖常用水為提取溶劑[20]，王德才等[21]經(jīng)脫脂、醇提后，采用水提醇沉法得杭白芷多糖的含量達(dá)15.38%，浸提工藝為95 ℃，浸提3次，每次2 h，分別加入6倍、5倍、4倍蒸餾水。于鑫等[22]以白扁豆為原料，以水為溶劑，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化建立多糖提取方法，浸提溫度為70 ℃，浸提時(shí)間為100 min，液料比為70∶1（mL∶g），在此條件下，白扁豆多糖得率為0.96%。

很多古方記載及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，某些白色類中藥具有美白、抗衰老、抗皺等功效[23]。如美白古方八白散由1∶1的茯苓、白芷等藥材組成，具有潤(rùn)澤肌膚、日用面如玉作用[24]；出自清《醫(yī)學(xué)集成（卷二）》的八仙糕中含有1∶1的茯苓、白扁豆等藥材，長(zhǎng)期服用具有益壽延年的作用[25]；清代美容方劑玉容散中含有1∶1∶1白芷、茯苓、白扁豆等藥材，用其洗面可以令肌膚白嫩[26]。目前，鮮有關(guān)于茯苓、白芷、白扁豆混合料多糖的提取研究報(bào)道。

本研究選用茯苓、白芷、白扁豆飲片混合料（1∶1∶1），采用水浸提方法提取其總多糖，以總多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)總多糖提取效果的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化總多糖提取工藝，以期為茯苓、白芷、白扁豆綜合應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓飲片、白芷飲片（均符合2020版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)）：湖北正光九資河藥業(yè)有限公司；白扁豆飲片（符合2020版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)）：湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司；D-無(wú)水葡萄糖（純度≥99.9%）標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；濃硫酸、苯酚（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU951型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；OSB-2200水浴鍋、EYEL4 N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、vacuubrand 2C型真空泵、CA-111型冷卻水循環(huán)裝置：上海愛(ài)朗儀器有限責(zé)任公司；SQP型電子天平（0.01 mg）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DSW-S-8電熱恒溫水浴鍋：北京光明醫(yī)療儀器有限公司；JJ1000型電子天平（0.01 g）：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；SK8200LHC超聲波清洗器：上海超導(dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合料總多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

稱取茯苓、白芷、白扁豆飲片各20.00 g，分別考察提取次數(shù)（1、2、3、4）、提取溫度（75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃）、提取時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL∶g））對(duì)茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率的影響。

1.3.2 混合料總多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總多糖得率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇液料比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）作為變量，設(shè)計(jì)3因素3水平L9（33）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化茯苓、白芷、白扁豆混合料提取工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 茯苓、白芷、白扁豆混合料提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization of tuckahoe, angelica and Baibiandou mixture

1.3.3 總多糖含量檢測(cè)

總多糖含量檢測(cè)參照文獻(xiàn)[27]。設(shè)定吸光度值波長(zhǎng)為495 nm，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.057 9x+0.009 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總多糖得率，公式如下：

式中：W表示總多糖得率，%；c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積，mL；m表示飲片稱樣量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合料總多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取次數(shù)的確定

提取次數(shù)對(duì)茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取次數(shù)對(duì)總多糖得率的影響Fig. 1 Effect of extraction times on yield of total polysaccharides

由圖1可知，提取1次總多糖得率為5.12%，提取2次總多糖得率為7.8%，提取3次總多糖得率為9.07%，第4次提取總多糖得率增加不明顯，且多次提取操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。綜合考慮，確定提取次數(shù)3次為宜。

2.1.2 提取溫度的確定

提取溫度對(duì)茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)總多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on yield of total polysaccharides

由圖2可知，隨著提取溫度在75～85 ℃范圍內(nèi)的升高，茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率增加，溫度高于85 ℃時(shí)，總多糖得率處于平穩(wěn)上升趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)到95 ℃時(shí)，總多糖得率最高，為8.36%。造成這種現(xiàn)象是由于多糖分子之間的運(yùn)動(dòng)速度隨著提取溫度的上升而不斷加快，而細(xì)胞組織中的多糖組分與溶劑之間的傳質(zhì)運(yùn)動(dòng)速度也隨之加快的原因[28]。因此，確定提取溫度95 ℃為宜。

2.1.3 提取時(shí)間的確定

提取時(shí)間對(duì)茯苓、白芷、白扁豆總多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on yield of total polysaccharides

由圖3可知，提取時(shí)間在1.0～2.5 h范圍內(nèi)時(shí)，茯苓、白芷、白扁豆總多糖得率隨提取時(shí)間的增加而升高；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)，總多糖得率最高，為8.73%；繼續(xù)增加提取時(shí)間至3.0 h時(shí)，總多糖得率有所下降。這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞[29]，降低了總多糖得率。此外，加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，能耗增加。因此，確定提取時(shí)間2.5 h適宜。

2.1.4 液料比的確定

液料比對(duì)茯苓、白芷、白扁豆總多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)總多糖得率的影響Fig. 4 Effect of liquid to solid ratio on yield of total polysaccharides

由圖4可知，液料比為6∶1、10∶1時(shí)，隨著液體占比增加，總多糖得率升高，當(dāng)液料比為10∶1時(shí)，總多糖得率為8.94%，繼續(xù)增加液體占比，至液料比至22∶1，總多糖得率呈緩慢上升趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著料液用量不斷增加，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓也隨之增加，多糖浸出越多，然而繼續(xù)增加料液，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓趨于平衡，多糖提取率呈緩慢上升趨勢(shì)[30]。在車間提取罐體積一定的條件下，液料比過(guò)大，會(huì)造成過(guò)多的溶劑浪費(fèi)。因此，確定液料比10∶1適宜。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖提取工藝

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以單因素試驗(yàn)所得最優(yōu)提取條件為基礎(chǔ)，選擇液料比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素，以總多糖得率為考察指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。茯苓、白芷、白扁豆總多糖混合提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction process optimization of total polysaccharides from tuckahoe,angelica and Baibiandou mixture

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analyasis of orthogonal experiments results

由表2可知，對(duì)總多糖得率的影響因素的主次順序依次為提取溫度（B）＞液料比（A）＞提取時(shí)間（C），最佳茯苓、白芷、白扁豆混合料中總多糖提取工藝組合為A2B3C2，即液料比10∶1（mL∶g）、提取溫度95 ℃、提取時(shí)間2.5 h，提取3次。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，總多糖平均提取率為8.88%。由表3可知，提取溫度對(duì)結(jié)果影響具有顯著性差異（P＜0.05），液料比、提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論

選用茯苓、白芷、白扁豆飲片為原料，采用浸提法提取其總多糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化混合料多糖的提取工藝。結(jié)果表明，茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖的最佳提取工藝為提取溫度95 ℃、液料比10∶1（mL∶g）、提取時(shí)間2.5 h、提取3次。在此優(yōu)化條件下，總多糖得率為8.88%。因此，采用該工藝提取茯苓、白芷、白扁豆3種飲片的總多糖，總多糖得率較高，工藝穩(wěn)定可行。