朱萬燕，張 偉，宋衛(wèi)得

（1.臨沂海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，山東 臨沂 276034；2.東營(yíng)海關(guān)，山東 東營(yíng) 257000；3.日照海關(guān)，山東 日照 276800）

谷物類食品是人類的重要食品來源之一，在人類的膳食結(jié)構(gòu)中占有重要地位[1]，此外，由于全谷物食品最大程度地保留了谷物中的營(yíng)養(yǎng)與活性成分，在預(yù)防慢性病等多個(gè)領(lǐng)域的健康功效得到了充分驗(yàn)證，愈來愈受到消費(fèi)者的認(rèn)同和重視[2]。近年來，隨著人們生活水平的提高，即食谷物類食品品種越來越多，為了增加產(chǎn)品的色澤，生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中加入各種各樣的色素，以吸引消費(fèi)者[3-4]。紅木素和降紅木素是經(jīng)不同提取溶劑從紅木種子中提取得到的食用天然色素[5]。該類色素因其色澤光亮鮮艷、著色力強(qiáng)，受到食品生產(chǎn)企業(yè)的青睞[6]，廣泛應(yīng)用到食品加工中。為了規(guī)范紅木素和降紅木素的合理使用，我國對(duì)該類色素的適用范圍和限量進(jìn)行了明確的規(guī)定[7]：用于干酪限量0.6 g/kg；人造奶油限量0.05 g/kg；糖果、果醬、飲料、果凍限量0.6 g/kg；糕點(diǎn)限量0.015 g/kg；肉灌腸類、西式火腿、巧克力限量0.025 g/kg；復(fù)合調(diào)味料限量0.1 g/kg；膨化食品、面糊、裹粉、煎炸粉限量0.01 g/kg；方便米面制品限量0.012 g/kg；即食谷物類食品限量0.07 g/kg；粉圓限量0.15 g/kg。

食品中關(guān)于合成色素的檢測(cè)報(bào)道較多，但關(guān)于食用天然色素的檢測(cè)研究較少[8-12]。目前，國外文獻(xiàn)中有關(guān)食用天然色素紅木素和降紅木素的報(bào)道大多是從紅木種子中提取該類色素的報(bào)道[13-15]，有關(guān)食品中該類色素檢測(cè)的探討不多[16-17]；國內(nèi)文獻(xiàn)中有關(guān)紅木素和降紅木素檢測(cè)的基質(zhì)大多是飲料、奶酪等[18-20]，未見有即食谷物類食品中該類色素的檢測(cè)；在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方面，國內(nèi)也只有一個(gè)進(jìn)出口食品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[21]。因此，為了維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、推動(dòng)該天然色素的合理使用，建立即食谷物類食品中紅木素和降紅木素的快速檢測(cè)方法顯得迫切且必要。

此外，目前用于食品中紅木素和降紅木素的檢測(cè)設(shè)備主要是液相色譜儀[22-23]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀[24]。上述檢測(cè)設(shè)備定性準(zhǔn)確度方面尚有不足，不能準(zhǔn)確闡明化合物的裂解信息，且對(duì)前處理的要求較高，操作繁復(fù)、耗時(shí)長(zhǎng)，不適合樣品的批量檢測(cè)。超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-timeofflightmassspectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）儀具有抗干擾能力更強(qiáng)、定性準(zhǔn)確度更高的特點(diǎn)[25]，如可以在滿足化合物檢出限的前提下，簡(jiǎn)化樣品前處理操作步驟，則可以大幅提高工作效率。以即食谷物食品為基質(zhì)，以期建立即食谷物類食品中紅木素和降紅木素的超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)方法，能準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速應(yīng)用于批量樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

即食谷物類食品（餅干、麥片、玉米片、核桃粉、芝麻糊等）：市售。

紅木素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS號(hào)6983-79-5）、降紅木素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS號(hào)542-40-5）（純度均≥98%）：美國ChromaDex公司；乙腈、甲酸、乙酸銨（色譜純）：美國Tedia公司；實(shí)驗(yàn)用水為美國Millipore純水系統(tǒng)制得的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6530型超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF MS）：美國安捷倫公司；CR22GⅢ日立高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；ULTRA-TURRAX T25型均質(zhì)器、GENIUS 3渦旋混勻器、HS260型多用調(diào)速振蕩器：德國IKA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于50 mg目標(biāo)待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品分別于50 mL燒杯中，用甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：實(shí)驗(yàn)過程中依據(jù)不同待測(cè)分析物的定量限，用樣品制得的空白提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同濃度的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

樣品預(yù)先打碎混合均勻備用。精確稱取2.00 g樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 5%醋酸-乙腈溶液，均質(zhì)提取1 min，然后置于水平振蕩器上振蕩30 min，以9 000 r/min冷凍（-2 ℃）離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液待測(cè)。

1.3.3 儀器工作條件

液相色譜條件：ZORBAXSB-C18色譜柱（100mm×2.1mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨），梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A；0.5～5 min，95%～60%A；5～9 min，60%～5%A；9～14 min，5%A；14～14.1 min，5%～95%A；14.1～18 min；95%A；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，正離子模式；霧化氣壓力45 psi；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速12 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細(xì)管電壓4 500 V；噴嘴電壓1 000 V；傳輸電壓110 V；除液電壓65 V；掃描范圍為50～1 700 m/z，掃描速率為3 spectra/s；數(shù)據(jù)采集與數(shù)據(jù)處理（定性分析和定量分析）均采用設(shè)備自帶軟件（version B.04.00）。

1.3.4 數(shù)據(jù)庫的建立

數(shù)據(jù)譜庫一般包括化合物名稱、分子式、理論相對(duì)分子質(zhì)量、離子化形式、保留時(shí)間、子離子掃描圖等信息，化合物名稱、分子式、理論相對(duì)分子質(zhì)量可從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上獲得，離子化形式、保留時(shí)間、子離子掃描圖均從實(shí)驗(yàn)獲得。上述實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)確定待測(cè)分析物的離子化形式為[M+H]+。

保留時(shí)間的確定：在上述確定的色譜質(zhì)譜條件下，配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行全掃描并采集數(shù)據(jù)，依據(jù)待測(cè)分析物的分子式及理論相對(duì)分子質(zhì)量，確認(rèn)其色譜峰，進(jìn)而獲得其色譜保留時(shí)間。

子離子掃描圖的獲得：子離子掃描模式下，在Targeted MS/MS界面輸入待測(cè)物的保留時(shí)間，母離子和不同的碰撞能量并采集數(shù)據(jù)，獲得不同碰撞能量下的子離子掃描質(zhì)譜圖，選取碎片離子信息豐富且碎片離子突出的質(zhì)譜圖作為子離子掃描圖，與對(duì)應(yīng)的待測(cè)物信息相關(guān)聯(lián)并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨）四種不同流動(dòng)相體系下紅木素和降紅木素的出峰情況，其離子流色譜圖見圖1。結(jié)果表明，紅木素和降紅木素在酸性體系下的響應(yīng)高于非酸性體系下的響應(yīng)，而且峰形也好；體系中加入乙酸銨后目標(biāo)化合物間及目標(biāo)化合物與雜峰間的分離度也有所改善，因此，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨）作為實(shí)驗(yàn)用流動(dòng)相。

圖1 紅木素（A）及降紅木素（B）的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ions chromatograms of bixin (A) and norbixin (B)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了正、負(fù)離子全掃描模式，結(jié)果表明，紅木素和降紅木素在負(fù)模式下沒有響應(yīng)，只有在正離子模式下有響應(yīng)，因而實(shí)驗(yàn)采用正離子模式進(jìn)行掃描。

正離子模式下，目標(biāo)分析物紅木素和降紅木素有[M+H]+、[M+Na]+兩種離子化形式，且兩種化合物[M+H]+離子化形式的響應(yīng)均高于[M+Na]+離子化的響應(yīng)，結(jié)果見圖2。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇[M+H]+離子化形式作為目標(biāo)化合物的母離子，并用于數(shù)據(jù)庫檢索。

圖2 紅木素（A）及降紅木素（B）不同離子化形式的響應(yīng)Fig. 2 Response of bixin (A) and norbixin (B) in different ionic forms

紅木素、降紅木素的保留時(shí)間、理論相對(duì)分子質(zhì)量和特征離子見表1。

表1 紅木素、降紅木素的保留時(shí)間和MS參數(shù)Table 1 Retention time and MS parameters of bixin and norbixin

2.3 方法考察

2.3.1 方法的線性和定量限

選取經(jīng)測(cè)定不含有目標(biāo)化合物的樣品，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，得到的提取液作為空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度在0.5～70 mg/kg范圍內(nèi)的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)定，以母離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）獲得目標(biāo)化合物的線性回歸方程。用空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，直至每種目標(biāo)化合物的信噪比（S/N）=10，此時(shí)對(duì)應(yīng)的化合物質(zhì)量濃度即為該化合物的定量限（limit of quantitation，LOQ）。紅木素、降紅木素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。

表2 紅木素及降紅木素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient and quantitation limits of bixin and norbixin

從表2可以看出，兩種化合物在1.0～70 mg/kg和0.5～70 mg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.99，線性關(guān)系良好；此外，兩種化合物的定量限分別為1.0 mg/kg和0.5 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其允許使用的限量，完全能夠滿足快速篩查的需要。

2.3.2 方法回收率和精密度

在經(jīng)測(cè)定不含有待測(cè)物質(zhì)的餅干、全麥片、玉米片3種樣品中分別添加1倍、5倍、10倍LOQ和70 mg/kg四個(gè)質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行做6次，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。由表3可知，兩種化合物的平均加標(biāo)回收率在71.5%～110.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于10.2%。

表3 不同食品中紅木素和降紅木素的加標(biāo)回收率和精密度Table 3 Standard recovery and precision of bixin and norbixin in different foods

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)40件購自超市的餅干、麥片、玉米片、核桃粉、芝麻糊等樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果只有一件夾心餅干樣品檢出降紅木素，檢出值為3.0 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究建立了即食谷物食品中紅木素和降紅木素的超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)法，紅木素和降紅木素兩種化合物分別在1.0～70 mg/kg、0.5～70 mg/kg范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.99，其定量限分別為1.0 mg/kg、0.5 mg/kg，平均加標(biāo)回收率在71.5%～110.6%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不高于10.2%。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、定性準(zhǔn)確度高，適用于批量樣品的快速篩查，可為食品安全監(jiān)管提供有效保障。