柳昊睿，邱 瑜，牟芳茗，耿曉琦，宋 佳*

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

醋蛋液作為我國(guó)一種傳統(tǒng)食品，是一種藥食兼用的飲品。醋蛋液是我國(guó)民間流傳很久的一種食療食品，我國(guó)也是世界上最早使用醋蛋液進(jìn)行保健的國(guó)家[1]。我們的祖先早已有用食醋浸泡雞蛋來治療某些疾病的先例。許多民間偏方也常用醋蛋液預(yù)防治療腮腺炎、灰指（趾）甲、毒蟲叮咬、腰腿痛等癥，所以自古就有“醋蛋治百病”之說[2-5]。近年來，有關(guān)醋蛋醫(yī)療保健以及藥理作用的研究報(bào)道越來越多。中醫(yī)理論認(rèn)為，食醋性溫味酸苦，有開胃、養(yǎng)肝、散瘀、止痛等功效[6]。雞蛋味甘性平，有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰定驚等作用[7]。兩者結(jié)合形成的醋蛋液具有抗氧化、降脂降壓、抑菌等主要功能，對(duì)失眠和食欲不振等多種常見疾病有良好的效果，深受醫(yī)學(xué)專家推崇[8]。

巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，作為一種多功能效應(yīng)細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中具有防御及調(diào)節(jié)功能[9-10]。巨噬細(xì)胞最重要的功能是吞噬功能，它可以通過直接吞噬外來抗原、損傷衰老細(xì)胞以及病原微生物進(jìn)而起到免疫清除的作用，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。除此之外可以通過呈遞抗原和分泌不同的活性物質(zhì)參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，主要表現(xiàn)在對(duì)先天免疫應(yīng)答中的重要作用[11]。CHEONG K T等[12]通過免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)表明，從冬蟲夏草中分離得到的多糖可以顯著改善巨噬細(xì)胞的細(xì)胞增殖和吞噬能力，并且通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信號(hào)通路釋放一氧化氮（nitrogen oxide，NO）和細(xì)胞因子從而提高機(jī)體的免疫能力。此外還有研究表明，甘草多糖還可以通過增加巨噬細(xì)胞體積，使其偽足增多，提高其表面積起到調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫作用[13]。

醋蛋液可以激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，提高機(jī)體免疫力進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抗感染及抗腫瘤能力。醋蛋液作用于U937細(xì)胞，可以促使其分泌大量細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（interleukin，IL-1β）、干擾素（interferon，IFN-γ）、腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF-α）及NO，起到免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)而誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化，抑制其生長(zhǎng)起到治療白血病的作用[14]。韋玉先等[15]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，醋蛋液能明顯促進(jìn)動(dòng)物腸的蠕動(dòng)，升高白細(xì)胞以及肝臟中鋅的含量，提高細(xì)胞免疫功能且實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)醋蛋液有任何不良的影響。

為了探究醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)活性，本研究采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit，CCK）-8法來檢測(cè)不同劑量的醋蛋液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫活性的影響，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下分別觀察不同分組條件下對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響及細(xì)胞核的損傷程度，探討醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌免疫因子的影響及其免疫調(diào)節(jié)活性的機(jī)理。以期對(duì)傳統(tǒng)食品的研究和應(yīng)用、對(duì)免疫調(diào)節(jié)類藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋：天津農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；8°梁汾醋：山西梁汾醋業(yè)有限公司；RAW264.7巨噬細(xì)胞：中科院武漢細(xì)胞庫；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、NO試劑盒：南京建成生物科技有限公司；IL-1β、TNF-α試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；無線電免疫沉淀反應(yīng)試驗(yàn)（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、JC-1染液、AnnexinV/PI結(jié)合液、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）完全培養(yǎng)基、胰酶（625 U/mL）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Hoechst33342染料：德國(guó)Hoechst AG公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：愛必信（上海）生物科技有限公司；CCK-8：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3110 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo有限公司；1X2-1LLJ100普通光學(xué)顯微鏡：日本Olympus有限公司；TE2000倒置熒光顯微鏡：日本Nikon有限公司；C6多功能細(xì)胞分析儀：美國(guó)BD有限公司；XH-600US 超聲波細(xì)胞破碎儀：美國(guó)Sonics有限公司；1703930電轉(zhuǎn)膜儀：美國(guó)Bio-Rad有限公司；Odyssey紅外激光成像儀：美國(guó)LI-COR生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋蛋液的制備

選擇一個(gè)新鮮雞蛋，用水和體積分?jǐn)?shù)75%乙醇清洗干凈，在4 ℃條件下用100 mL 8°梁汾醋浸泡72 h后將蛋液攪拌均勻，充分混合均勻后用兩層消毒紗布過濾以除去破碎的蛋膜，置于8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液即為醋蛋液，制備的樣品保存在20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 醋蛋液劑量篩選

利用CCK-8試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞活性從而對(duì)醋蛋液的劑量進(jìn)行篩選。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7約5×104個(gè)/mL接種至96孔板中，每孔加入量為100 μL，在不同孔中加入不同質(zhì)量濃度的樣品（2.5 μL/mL、5.0 μL/mL、10.0μL/mL、20.0μL/mL、40.0μL/mL、50.0μL/mL、100.0μL/mL）處理RAW264.7細(xì)胞。將96孔板置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，終止培養(yǎng)，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各孔吸光度值，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行。細(xì)胞活力計(jì)算公式如下：

式中：A加藥為檢測(cè)孔（含有細(xì)胞、CCK-8和藥物溶液）吸光度值；A空白為空白孔（含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液）吸光度值；A未加藥為空白對(duì)照孔（含有細(xì)胞和CCK-8溶液）吸光度值。

1.3.3 細(xì)胞分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

巨噬細(xì)胞RAW264.7分成空白組（加入DMEM完全培養(yǎng)基）、乙酸加雞蛋組（其中乙酸含量參考梁汾醋中含量，浸泡過程如醋蛋液浸泡過程）、水加雞蛋組、梁汾醋加雞蛋高劑量組（醋蛋液高劑量組）（20 μL/mL）、梁汾醋加雞蛋低劑量組（醋蛋液低劑量組）（5 μL/mL）、對(duì)照組（加入1 μg/mL的LPS）。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后倒去上清液，不同孔中加入不同分組的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸去上層細(xì)胞培養(yǎng)液，放置在倒置熒光顯微鏡下觀察不同分組條件下的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.5 培養(yǎng)液中細(xì)胞免疫及體液免疫因子的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞RAW264.7接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后倒去上清液，空白組、對(duì)照組和不同濃度的醋蛋液劑量組中分別加入不同的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，置于離心機(jī)中1 000 r/min離心10 min，取上清液按照NO、IL-1β、TNF-α試劑盒的方法測(cè)定培養(yǎng)液中細(xì)胞免疫以及體液免疫因子的含量。

1.3.6 細(xì)胞核損傷檢測(cè)

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞RAW264.7，按照5×104個(gè)/mL的濃度接種在6孔板中，將不同濃度的醋蛋液樣品溶液或LPS處理RAW264.7細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。隨后倒去上清液每孔中加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），此外再向每孔中加入1 μL 1 mg/mL的Hoechst33342染料，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育5 min，隨后終止培養(yǎng)。吸去染液后用預(yù)冷PBS緩緩沖洗細(xì)胞2～3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的損傷情況，并進(jìn)行拍照。

1.3.7 線粒體膜電位的分析

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，使用不同濃度的醋蛋液或LPS處理RAW264.7細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。用DMEM完全培養(yǎng)基將JC-1染液稀釋至質(zhì)量濃度為5 μg/mL的工作液，每孔2 mL體系，在細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃條件下孵育20 min，去除細(xì)胞上清，事先預(yù)冷的PBS緩緩沖洗細(xì)胞兩次，為防止熒光淬滅需要在1 h內(nèi)完成觀察拍照。

1.3.8 AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，使用不同濃度的醋蛋液或LPS處理RAW264.7細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。用200 μL胰酶消化RAW264.7細(xì)胞，收集每孔細(xì)胞，4 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷的PBS沖洗2～3次。首先用0.5 mL AnnexinV/PI結(jié)合液重懸細(xì)胞，后加入5 μL AnnexinV染液，混勻，低溫避光條件下孵育15 min；隨后再向其中加入5 μL PI染液，混和均勻，低溫避光條件下再孵育5 min，此外單獨(dú)設(shè)置單染組以及陽性對(duì)照組，防止熒光淬滅需在1 h內(nèi)上機(jī)完成檢測(cè)。

1.3.9 蛋白免疫印跡檢測(cè)

將收集好的細(xì)胞放入離心管內(nèi)，4 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清后加入1 mL預(yù)冷PBS緩沖液重懸，重復(fù)以上操作過程洗滌兩次，將樣品放于冰上。加入0.1 mLRIPA裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）溶液，反復(fù)吹打后在冰上充分裂解30 min，期間每隔10 min渦旋一次。低溫環(huán)境下12 000 r/min離心5 min，采用BCA試劑盒測(cè)定制備樣品中的總蛋白含量并將樣品調(diào)成相同濃度，按照樣品∶蛋白緩沖液=1∶4的比例加入5倍的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖溶液并將其混合均勻。100 ℃沸水中反應(yīng)8 min后冷卻離心，取上清按分組分裝在500 μL離心管中，放置在-80 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。隨后進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育相應(yīng)蛋白對(duì)應(yīng)的一抗與二抗。最后聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。用Image J v1.8.0軟件對(duì)目標(biāo)帶的分子質(zhì)量和凈光密度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品數(shù)據(jù)集至少重復(fù)3次，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和Tukey相關(guān)分析。用Origin 9.0繪制圖形，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

由圖1可知，醋蛋液的濃度范圍為2.5～100 μL/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)醋蛋液濃度為40 μL/mL時(shí)，細(xì)胞活力極顯著升高為（145.3±23.02）%（P＜0.01）。在此之前，當(dāng)醋蛋液濃度在5～20 μL/mL之間時(shí)，細(xì)胞活力已經(jīng)出現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇5 μL/mL和20 μL/mL作為低、高劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同濃度的醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of vinegar egg-juice on cell viability of macrophages RAW264.7

2.2 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖2可知，正常分組條件下細(xì)胞輪廓清晰，呈現(xiàn)較為規(guī)則的圓形且增殖能力良好。給藥一定劑量的乙酸、雞蛋以及醋蛋液后巨噬細(xì)胞開始出現(xiàn)較低程度的變形，細(xì)胞開始呈現(xiàn)梭形以及橢圓形并逐漸長(zhǎng)出偽足。乙酸、雞蛋以及醋蛋液低劑量（5 μL/mL）組間差異不大，但醋蛋液高劑量組（20 μL/mL）相比低劑量組形態(tài)變化明顯。給藥LPS后細(xì)胞體積明顯變大，呈現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài)且具有較高程度的變形，出現(xiàn)較多的突觸細(xì)胞以及長(zhǎng)梭形細(xì)胞。細(xì)胞膜破損導(dǎo)致細(xì)胞液外泄，折光性變差，并可見伸展性較好的偽足。形態(tài)結(jié)果顯示給藥LPS可以使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生典型的炎癥相關(guān)形態(tài)特征并進(jìn)一步誘發(fā)巨噬細(xì)胞的炎癥相關(guān)形態(tài)學(xué)特征。

圖2 醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of vinegar egg-juice on cell morphology of macrophages RAW264.7

2.3 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響

激活后的巨噬細(xì)胞可以分泌出不同的趨化因子及細(xì)胞因子，在激活機(jī)體的適應(yīng)性免疫和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面起著非常重要的作用。其中主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-1（IL-1）是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子可以分為IL-1α與IL-1β兩種構(gòu)型。其中IL-1可以激活并參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞與B細(xì)胞的活化、增殖與分化的過程，在傳遞信息、免疫反應(yīng)中起著重要作用[16]?？鼓[瘤因子（TNF-α）是一種對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，屬于TNF超家族配體。TNF-α是一種多向性的促炎細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞分化，在自身免疫疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及炎癥中有著至關(guān)重要的作用[17]。

由圖3可知，與空白組相比，雞蛋組與醋蛋低劑量組（5 μL/mL）上清中IL-1β以及TNF-α均未有顯著差異（P＞0.05）。但孵育高劑量的醋蛋液（20 μL/mL）和LPS可以顯著提高細(xì)胞免疫因子IL-1β以及TNF-α的釋放（P＜0.05）。與空白組相比，高劑量的醋蛋液組（20 μL/mL）對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β以及TNF-α的含量分別提高了155.83%和8.81%。一定程度上表明醋蛋液具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

圖3 醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌免疫因子IL-1β（A）、TNF-α（B）及NO（C）的影響Fig. 3 Effect of vinegar egg-juice on secretion of immune factor IL-1β (A), TNF-α (B) and NO (C) of macrophages RAW264.7

NO是由巨噬細(xì)胞分泌的一種具有生物活性的細(xì)胞信使因子，由NO合成酶（nitric oxide synthase，NOS）合成，是一種具有氧化性能的自由基[18]。NO具有殺滅病原微生物的作用，能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞的凋亡，具有較強(qiáng)的殺傷能力。因而NO被認(rèn)為是一種細(xì)胞內(nèi)信使分子可以介導(dǎo)各種生物反應(yīng)的發(fā)生，其分泌量是巨噬細(xì)胞的免疫活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。由圖3C可知，醋蛋液高劑量組（20 μL/mL）以及LPS組均可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO，而其他分組孵育巨噬細(xì)胞無明顯差異（P＞0.05）。

2.4 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞核形態(tài)的影響

由圖4可知，通過熒光顯微鏡可以看到乙酸組、雞蛋組以及醋蛋低劑量組（5 μL/mL）與空白組無顯著性差異（P＞0.05），屬于細(xì)胞的正常凋亡。但醋蛋高劑量組（20μL/mL）細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮成塊或核破碎的情況減少，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，有效緩解了細(xì)胞損傷程度。隨著醋蛋液劑量在5～20 μL/mL增高，細(xì)胞損傷情況逐漸緩解，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞核脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）出現(xiàn)明顯的損傷，并進(jìn)一步加重核破裂和核染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜逐漸呈現(xiàn)損傷，結(jié)構(gòu)模糊不清。

圖4 醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig. 4 Effect of vinegar egg-juice on cell nuclear morphology of macrophages RAW264.7

2.5 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種用于檢測(cè)細(xì)胞及組織線粒體膜電位變化的熒光探針，JC-1染料以電勢(shì)依賴性的方式聚集在線粒體內(nèi)，可以通過紅綠熒光的變化進(jìn)行細(xì)胞、組織或鈍化的線粒體膜電位的監(jiān)測(cè)[19-20]。由圖5可知，正常巨噬細(xì)胞線粒體中JC-1以聚合物的形式存在，呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，細(xì)胞中的綠色熒光非常弱。加入LPS后在線粒體基質(zhì)中JC-1不能以聚合物的形式存在，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而線粒體內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），而細(xì)胞漿中綠色熒光顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。此外紅/綠熒光的相對(duì)比率的顯著降低（P＜0.05），進(jìn)一步表明線粒體功能受到障礙，細(xì)胞受損。與正常組的巨噬細(xì)胞相比，乙酸組、雞蛋組以及醋蛋低劑量組（5 μL/mL）無顯著性差異（P＞0.05），屬于正常的細(xì)胞損傷過程。但乙酸組的紅/綠熒光的相對(duì)比率相對(duì)較低，可能是由于乙酸對(duì)細(xì)胞具有一定的刺激作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位變低。隨著醋蛋液劑量的增加，醋蛋液高劑量（20 μL/mL）處理的細(xì)胞與正常的巨噬細(xì)胞以及LPS處理的細(xì)胞相比細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度逐漸減弱，紅色熒光逐漸增強(qiáng)，可以緩解細(xì)胞膜電位降低造成的細(xì)胞損傷。崔曉楓[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃傘菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7，細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染且有顏色發(fā)白的碎片的現(xiàn)象。且經(jīng)過黃傘菌次級(jí)代謝產(chǎn)物孵育后紅色熒光逐漸減少，綠色熒光逐漸增加，膜電位下降，對(duì)巨噬細(xì)胞有一定的損傷作用。

圖5 醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞膜電位的影響Fig. 5 Effect of vinegar egg-juice on cell membrane potential of macrophages RAW264.7

2.6 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響

由圖6可知，右下象限和右上象限分別表示凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，左下象限表示活細(xì)胞。乙酸與LPS處理后的細(xì)胞凋亡率（膜聯(lián)蛋白V+細(xì)胞/總細(xì)胞）顯著上升（P＜0.05），分別達(dá)到（25.5±1.89）%和（29.3±3.01）%，說明乙酸以及LPS均對(duì)巨噬細(xì)胞有一定的損傷作用。雞蛋處理的巨噬細(xì)胞與正常細(xì)胞無異，高劑量的醋蛋液（20 μL/mL）可減少細(xì)胞的凋亡，可緩解巨噬細(xì)胞的凋亡，對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。且隨著醋蛋液劑量的增加，保護(hù)效果越明顯，具有一定的量效關(guān)系。介怡琳等[22]也研究發(fā)現(xiàn)，從雞蛋蛋黃中提取的不同濃度的卵黃高磷蛋白均可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖并起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，但質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)效果最佳。

圖6 醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of vinegar egg-juice on apoptosis of macrophages RAW264.7

2.7 醋蛋液對(duì)RAW264.7細(xì)胞免疫相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫相關(guān)蛋白（蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation of protein kinase B，P-AKT）、NF-κB、磷酸化（P）-NF-κB、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH））表達(dá)情況見圖7。

圖7 醋蛋液對(duì)免疫相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 7 Effect of vinegar egg-juice on expression levels of immune-associated protein

由圖7可知，給藥高劑量醋蛋液（20 μL/mL）以及雞蛋，巨噬細(xì)胞中AKT以及NF-κB的蛋白表達(dá)量明顯高于空白組但相比LPS組較低。一定程度上表明醋蛋液和雞蛋都具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，但醋蛋液的效果明顯高于雞蛋。與空白組相比，醋蛋液高劑量組（20 μL/mL）對(duì)AKT及NF-κB的蛋白表達(dá)量分別增加了28.98%和31.27%。這些結(jié)果說明激活NF-κB和AKT通路參與醋蛋液激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[23-25]。

3 結(jié)論

本研究考察了不同劑量醋蛋液對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核形態(tài)的影響，結(jié)果表明，高劑量醋蛋液（20 μL/mL）可使細(xì)胞折光性變強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)變化明顯；高劑量醋蛋液可以明顯減少細(xì)胞凋亡的數(shù)量，有效緩解了細(xì)胞核損傷程度；高劑量醋蛋液可顯著增強(qiáng)細(xì)胞免疫因子IL-1β以及TNF-α的釋放。高劑量醋蛋液可提高巨噬細(xì)胞中NF-κB和AKT關(guān)鍵蛋白表達(dá)量，其分別上調(diào)了28.98%和31.27%，表明高劑量醋蛋液通過激活免疫通路，以強(qiáng)化巨噬細(xì)胞免疫能力。此研究對(duì)免疫調(diào)節(jié)類藥物的開發(fā)提供了新思路，在未來醫(yī)藥領(lǐng)域潛力巨大，同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)食品的研究和應(yīng)用提供了新思路。