王靈杰，栗青麗，高培軍,2，韋賽君，呂嘉欣，高 巖,2，張汝民,2

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

光合作用在綠葉中進(jìn)行，也可在非同化器官葉柄，綠花，花萼，綠色水果，球果，莖組織，甚至根中發(fā)生[1?4]。非同化器官光合作用，無(wú)論表現(xiàn)為凈光合作用還是內(nèi)部二氧化碳(CO2)再固定，都是增加碳獲取的重要方式[5]。蔡錫安等[6]研究發(fā)現(xiàn)植物莖稈組織能同化樹(shù)干向生境排放的60%～90%CO2。LIU等[7]研究發(fā)現(xiàn)莖光合作用能夠促進(jìn)旱柳Salix matsudana扦插幼苗的器官發(fā)育。在干旱林地或沙漠中發(fā)現(xiàn)一些常見(jiàn)木本植物依賴綠莖作為碳同化器官[8]。áVILA-LOVERA等[9]發(fā)現(xiàn)霍金斯樹(shù)Cercidium praecox在雨季主要由葉片進(jìn)行光合作用，在旱季葉片完全脫落，主要由綠莖發(fā)生光合作用。植物碳同化方式多種多樣，花環(huán)結(jié)構(gòu)與3種不同細(xì)胞類型被認(rèn)為是C4光合碳同化途徑關(guān)鍵特征[10]。HIBBERD等[11]發(fā)現(xiàn)在典型C3植物煙草Nicotiana tabacum和芹菜Apium graveolens中，木質(zhì)部和韌皮部周圍的莖和葉柄細(xì)胞表現(xiàn)出NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)型細(xì)胞類型特征，這些細(xì)胞需要的碳來(lái)自于呼吸作用。SHEN等[12]發(fā)現(xiàn)水稻Oryza sativa葉片中脈具有C4光合特性。王瑩等[13]發(fā)現(xiàn)木本植物丁香Syringa meyeri，銀白楊Populus alba，落葉松Larix gmelinii綠色莖稈組織中均表現(xiàn)出典型C4光合生化特征。毛竹Phyllostachys edulis屬禾本科Gramineae亞熱帶竹種，自然分布于中國(guó)南方省份，具有生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，固碳能力強(qiáng)等特點(diǎn)。目前，關(guān)于毛竹光合作用前人已做了一些工作，溫星等[14]發(fā)現(xiàn)毛竹幼葉葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和凈光合速率隨其生長(zhǎng)發(fā)育不斷增加，從幼葉生長(zhǎng)至第15天完全展葉，葉片就具備正常的光合生理功能。陳登舉等[15]發(fā)現(xiàn)毛竹莖稈中光合色素含量較高，葉綠體發(fā)育完整，其類囊體垛疊程度高于葉片并含有淀粉粒。同時(shí)，毛竹在糖代謝[16]、激素調(diào)節(jié)[17]、非生物脅迫[18]、基因組鑒定與表達(dá)分析[19?20]等方面研究取得了較好的進(jìn)展，但毛竹筍快速生長(zhǎng)期莖稈光合碳同化分子特征的研究鮮有報(bào)道。本研究以快速生長(zhǎng)階段毛竹筍竹為研究對(duì)象，測(cè)定毛竹莖稈不同節(jié)間C3光合碳同化途徑關(guān)鍵酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)、C4光合碳同化關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)、NADP-ME、NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP-CK)活性及各個(gè)關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量，探討毛竹快速生長(zhǎng)期筍竹莖稈光合碳同化規(guī)律，以期為進(jìn)一步揭示毛竹莖稈快速生長(zhǎng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試毛竹來(lái)自浙江省杭州市臨安區(qū)青山湖街道毛竹高效示范園。2018年4月中旬至5月下旬，選取生長(zhǎng)狀況良好，生境相同，株高6.0±0.2 m，基徑約15 cm的當(dāng)年自然生毛竹筍竹，在10:00?12:00從莖稈基部將其伐倒，由基部至頂部方向第1節(jié)間起順序編號(hào)，依次取編號(hào)為7、10、13、16、19節(jié)間，切取各節(jié)間1/3處下部的綠色外層組織，取樣厚度2～3 mm。成熟葉片樣品采自成竹冠層，在同一生境和采樣時(shí)間段選取生長(zhǎng)狀況良好的自然生成竹，取其冠層無(wú)斑點(diǎn)、無(wú)病害、延展性良好、大小均一的深綠色成熟葉片，去葉脈。節(jié)間組織和葉片樣品均液氮冷凍，?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?株毛竹筍竹，5次重復(fù)，每株為1個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 酶液提取與酶活測(cè)定 酶液提取參照BERVEILLER等的方法[20]，稍有改動(dòng)。取待測(cè)毛竹筍竹綠色莖稈和葉片各0.5 g分置于研磨機(jī)中，加入5 mL預(yù)冷的提取液，研磨至勻漿。12 000 r·min?1離心30 min，取上清液即為粗酶液。Rubisco酶活性的測(cè)定參照姜振升等[21]的方法。PEPC和NADP-ME活性測(cè)定參照BERVEILLER等的方法[20]。NADP-MDH活性測(cè)定參照J(rèn)OHNSON等的方法[22]。 PEPCK活性測(cè)定參照BURNELL的方法[23]。 PPDK活性測(cè)定參照HATCH等的方法[24]。

1.2.2 毛竹筍竹莖稈和葉片總RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)及反轉(zhuǎn)錄 毛竹筍竹莖稈和葉片總RNA的提取使用寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa) RNAiso Plus (Code No.9109)*試劑盒，按其說(shuō)明書的方法提取。使用Nano-100微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與質(zhì)量，用瓊脂糖(添加量為12 g·L?1)凝膠電泳篩選可用RNA。反轉(zhuǎn)錄使用寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒，按其說(shuō)明書的方法合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于?20 ℃保存。

1.2.3 熒光定量PCR 通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PLAZ 4.0 Monocots(https://bioinformatics. psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v4_monocots/)搜索毛竹光合關(guān)鍵酶基因CDS序列，所有用于目的基因表達(dá)的定量引物序列(表1)均利用NCBI引物設(shè)計(jì)工具Primer-BLAST設(shè)計(jì)，同源比對(duì)后由浙江有康生物科技有限公司合成。各個(gè)基因表達(dá)分析使用寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)TB Green? Premix Ex Taq ? Ⅱ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)。反應(yīng)體系20 μL，采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序在Bio-Rad CFX manager 3.1 PCR儀上擴(kuò)增。定量結(jié)果采用2－ΔΔCt的方法計(jì)算[25]，選用毛竹PeNTB作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用Origin 9.0軟件(OriginLab公司, 美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。采用one-way ANOVA進(jìn)行Tukey多重比較(P＜0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同節(jié)間和葉片 Rubisco 和 PEPC 活性變化

由圖1可知：毛竹葉片Rubisco初始活性最高，極顯著高于莖稈快速生長(zhǎng)節(jié)間(P＜0.01)，分別是第7、10、13、16、19節(jié)間的1.69、2.45、2.95、3.87、13.40倍；隨著節(jié)間的升高，Rubisco初始活性呈下降趨勢(shì)，第7節(jié)間Rubisco初始活性高于其他節(jié)間。第19節(jié)間Rubisco活性最低，極顯著低于葉片和第7節(jié)間(P＜0.01)，分別下降了92.5%和87.4%。

圖1 毛竹莖稈不同節(jié)間Rubisco初始活性變化Figure 1 Changes of initial activity of Rubisco in different internodes of the Ph. edulis stems

由圖2可知：莖稈第7節(jié)間PEPC活性最高，極顯著高于莖稈其他節(jié)間及葉片(P＜0.01)，分別是第10、13、16、19節(jié)間和葉片的1.70、2.19、3.01、5.70和3.01倍；隨著節(jié)間的升高，PEPC活性呈下降趨勢(shì)，第19節(jié)間PEPC活性最低，與第7節(jié)間相比下降了82.5%(P＜0.01)。毛竹莖稈第7～19節(jié)間PEPC活性整體呈先極顯著下降(P＜0.01)而后在低水平趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。

2.2 不同節(jié)間和葉片 NADP-MDH 和 NADP-ME 活性變化

由圖3可知：莖稈第7節(jié)間NADP-MDH酶活性最高，極顯著高于13～19節(jié)間及葉片(P＜0.01)，分別是第10、13、16、19節(jié)間和葉片的1.45、1.87、2.14、4.50和4.46倍；隨著節(jié)間的升高，NADPMDH活性呈下降趨勢(shì)，第19節(jié)間NADP-MDH活性最低，與第7節(jié)間相比下降了77.8%(P＜0.01)。毛竹莖稈第7～19節(jié)間NADP-MDH酶活性整體呈先下降而后在低水平趨于平穩(wěn)的變化規(guī)律。

由圖4可知：莖稈第7節(jié)間NADP-ME酶活性最高，極顯著高于13～19節(jié)間及葉片(P＜0.01)，分別是第10、13、16、19節(jié)間和葉片的1.55、2.86、3.73、4.27和5.69倍；隨著節(jié)間的升高，NADP-ME活性呈下降趨勢(shì)，第19節(jié)間NADP-ME活性最低，與第7節(jié)間相比下降了76.6%(P＜0.01)。毛竹莖稈第7～19節(jié)間NADP-ME酶活性整體呈下降，而后趨于平穩(wěn)的變化規(guī)律。

圖4 毛竹不同部位NADP-ME活性變化Figure 4 Changes of activity of NADP-ME in different internodes of the Ph. edulis stems

2.3 不同節(jié)間和葉片PEP-CK 和PPDK 活性變化

由圖5可知：莖稈各節(jié)間與毛竹葉片PEP-CK活性無(wú)顯著性差異。由圖6可知：毛竹莖稈第7節(jié)間PPDK酶活性最高，極顯著高于其他節(jié)間及葉片(P＜0.01)，分別是第10、13、16、19節(jié)間和葉片的1.69、2.15、2.38、2.69和4.05倍；隨著節(jié)間的升高，PPDK活性呈下降趨勢(shì)，第19節(jié)間PPDK活性最低，與第7節(jié)間相比下降了62.9%(P＜0.01)。毛竹莖稈第7～19節(jié)間PPDK活性整體呈極顯著下降(P＜0.01)，而后趨于平穩(wěn)的變化規(guī)律。

圖5 毛竹不同部位PEP-CK活性變化Figure 5 Changes of activity of PEP-CK in different internodes of the Ph. edulis stems

圖6 毛竹不同部位PPDK活性變化Figure 6 Changes of activity of PPDK in different internodes of the Ph.edulis stems

2.4 毛竹莖稈提取總RNA完整性及純度檢測(cè)

由圖7可知：提取毛竹莖稈總RNA的瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰、明亮，分離明顯，28S和18S處的條帶亮度是5S處條帶亮度的2倍，可見(jiàn)樣品總RNA完整，未降解。

圖7 毛竹莖稈總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 7 Total RNA agarose gel electrophoresis of bamboo stalks

2.5 不同節(jié)間和葉片Percbl及PePEPC基因相對(duì)表達(dá)量的變化

由圖8可知：莖稈7～19節(jié)間和葉片Percbl基因表達(dá)豐度不同，毛竹葉片Percbl基因相對(duì)表達(dá)豐度最高，極顯著高于莖稈快速生長(zhǎng)節(jié)間(P＜0.01)，分別是第7、10、13、16、19節(jié)間的1.30、2.13、5.41、12.94、18.51倍。隨著節(jié)間的升高，Percbl基因相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，第19節(jié)間Percbl基因相對(duì)表達(dá)量最低，極顯著低于葉片和第7節(jié)間(P＜0.01)，相比分別下降了94.6%和93.0%。

圖8 不同部位毛竹筍竹Percbl基因相對(duì)表達(dá)量Figure 8 Relative expression ration of Percbl gene in different parts of the Ph. edulis stems

由圖9可知：莖稈7～19節(jié)間和毛竹葉片PePEPC基因相對(duì)表達(dá)量不同，莖稈第7節(jié)間PePEPC基因相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于葉片及各個(gè)節(jié)間(P＜0.01)，分別是葉片、第10、13、16、19節(jié)間的2.43、1.82、2.50、2.95、3.48倍。隨著節(jié)間的升高，PePEPC基因相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，第19節(jié)間PePEPC基因相對(duì)表達(dá)量最小，極顯著低于葉片和第7節(jié)間(P＜0.01)，分別下降了30.1%和71.3%。

圖9 不同部位毛竹筍竹PePEPC基因相對(duì)表達(dá)量Figure 9 Relative expression ration of PePEPC gene in different parts of the Ph. edulis stems

2.6 不同節(jié)間和葉片PeNADP-MDH及 PeNADPME基因相對(duì)表達(dá)量的變化

由圖10可知：莖稈 7～19節(jié)間和毛竹葉片PeNADP-MDH基因相對(duì)表達(dá)量不同，第7節(jié)間PeNADP-MDH基因相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于葉片及各個(gè)節(jié)間(P＜0.01)，分別是葉片、10、16、19、22節(jié)間的3.43、1.82、2.73、4.73、6.48倍。隨著節(jié)間的升高，PeNADP-MDH基因相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，第19節(jié)間PeNADP-MDH基因相對(duì)表達(dá)量最低，極顯著低于葉片和第7節(jié)間(P＜0.01)，相比分別降低了47.0%和84.6%。

圖10 不同部位毛竹筍竹PeNADP-MDH基因相對(duì)表達(dá)量Figure 10 Relative expression ration of PeNADP-MDH gene in different parts of the Ph. edulis stems

由圖11可知：莖稈7～19節(jié)間和毛竹葉片PeNADP-ME基因相對(duì)表達(dá)量不同，第7節(jié)間PeNADPME基因相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于葉片及各個(gè)節(jié)間(P＜0.01)，分別是葉片、10、13、16、19節(jié)間的3.27、2.25、3.41、3.99、7.89倍。隨著節(jié)間的升高，PeNADP-ME基因相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)，第19節(jié)間PeNADP-ME基因相對(duì)表達(dá)量最低，極顯著低于葉片和第7節(jié)間(P＜0.01)，分別降低了58.5%和87.3%。

圖11 不同部位毛竹筍竹PeNADP-ME基因相對(duì)表達(dá)量Figure 11 Relative expression ration of PeNADP-ME gene in different parts of the Ph. edulis stems

2.7 不同節(jié)間和葉片PePEP-CK及PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量的變化

由圖12可知：莖稈7～19節(jié)間和毛竹葉片PePEP-CK基因相對(duì)表達(dá)量不同，各個(gè)節(jié)間PePEP-CK基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于葉片(P＜0.01)，第7～19節(jié)間PePEP-CK基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異。

圖12 不同部位毛竹筍竹PePEP-CK基因相對(duì)表達(dá)量Figure 12 Relative expression ration of PePEP-CK gene in different parts of the Ph. edulis stems

由圖13可知：莖稈7～19節(jié)間和毛竹葉片PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量不同，第7節(jié)間PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于葉片及各個(gè)節(jié)間(P＜0.01)，分別是葉片、10、13、16、19節(jié)間的5.57、1.39、1.80、2.70、3.46倍。隨著節(jié)間的升高，PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，第19節(jié)間PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量最低，與第7節(jié)相比降低了71.1%(P＜0.01)。

圖13 不同部位毛竹筍竹PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量Figure 13 Relative expression ration of PePPDK gene in different parts of the Ph. edulis stems

3 討論

植物光合碳固定主要通過(guò)C3途徑進(jìn)行，也可由C4途徑進(jìn)行[26?27]。IVANOV等[28]研究發(fā)現(xiàn)歐洲赤松Pinus sylvestris樹(shù)皮和針葉NAD-ME、NADP-ME和PEPC活性較低，認(rèn)為莖稈光合碳固定主要是C3途徑；BERVEILLER等[29]研究發(fā)現(xiàn)成年歐洲山毛櫸Fagus sylvatica樹(shù)干和葉片Rubisco及PEPC動(dòng)力學(xué)和免疫學(xué)特征與C3植物一致。HIBBERD等[11]研究發(fā)現(xiàn)煙草莖和葉柄周圍細(xì)胞存在類似C4植物的花環(huán)束鞘結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞NADP-ME、NADP-MDH和PEP-CK活性較高，認(rèn)為此部位主要以C4途徑固定無(wú)機(jī)碳。本研究中，毛竹莖稈快速生長(zhǎng)節(jié)間PEPC、NADP-ME、NADP-MDH、PPDK活性均極顯著高于葉片，莖稈Rubisco活性均極顯著低于葉片，這與王瑩等[13]對(duì)不同木本植物枝條中C4酶活性普遍高于葉片的研究結(jié)果相一致。結(jié)合毛竹莖稈存在與C4植物相類似的花環(huán)結(jié)構(gòu)[30]，推斷毛竹莖稈快速生長(zhǎng)階段莖稈主要通過(guò)C4途徑固定CO2。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)莖稈節(jié)位越高C4途徑關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)越低。這是因?yàn)榍o稈下部節(jié)間已發(fā)育成熟竹籜脫落，節(jié)間裸露于有光環(huán)境中，光合作用活躍；上部節(jié)間竹籜未脫落，光不能被莖稈接收，光合作用無(wú)法進(jìn)行，這與王珂楊等[31]對(duì)毛竹莖稈中下部節(jié)間PSⅡ反應(yīng)中心活性強(qiáng)，光能轉(zhuǎn)換效率高，上部節(jié)間光合功能弱生長(zhǎng)緩慢的研究結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

非同化器官光合固碳方式可能與相關(guān)光合酶基因選擇性表達(dá)密切相關(guān)。黑楊Populus nigra中存在與玉米高同源性的PEPC基因，其莖組織有明顯高水平選擇性表達(dá)，對(duì)其碳代謝有潛在積極作用[32]。煙草莖和葉柄光合細(xì)胞通過(guò)優(yōu)先、特異性地表達(dá)高活性NADP-ME、NADP-MDH和PEP-CK固定無(wú)機(jī)碳[11]。本研究中，毛竹莖稈快速生長(zhǎng)節(jié)間PeNADP-ME基因和PeNADP-MDH基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于葉片，莖稈PePEPC基因和PePPDK基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于葉片，莖稈快速生長(zhǎng)節(jié)間Rubisco基因Perbcl相對(duì)表達(dá)量極顯著低于葉片，與其酶活性水平具有一致性，這與LI等[32]對(duì)雜種黑楊Populus simonii × P. nigra莖組織PsnPEPC2基因高水平表達(dá)的研究結(jié)果類似。表明毛竹莖稈由C4途徑固定無(wú)機(jī)碳可能受基因水平的調(diào)控，莖稈內(nèi)PEPC催化無(wú)機(jī)碳羧化形成草酰乙酸，之后主要通過(guò)NADP-ME型和NAD-ME型通路由NADP-ME和NADP-MDH進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這與煙草葉柄和芹菜中C4同化途徑類似[11]。毛竹莖稈速生時(shí)期以C4途徑固定無(wú)機(jī)碳可能是其能進(jìn)行高效生長(zhǎng)的重要原因之一。

植物組織用于光合作用的CO2主要來(lái)源于大氣，一些木本植物莖稈、樹(shù)干組織氣孔較少，外皮層組織間排列緊密，氣體通透性差，大氣CO2難以擴(kuò)散進(jìn)莖稈皮層綠色組織[6]。木本植物樹(shù)枝和莖稈光合作用普遍被認(rèn)為利用內(nèi)部代謝及呼吸產(chǎn)生的CO2[5]。根系吸收的無(wú)機(jī)碳鹽和自身組織呼吸作用釋放的CO2會(huì)被裝載到木質(zhì)部液流供莖稈光合細(xì)胞重新固定利用[11]。本研究中，毛竹莖稈表皮不具氣孔，大氣CO2不能由氣孔擴(kuò)散進(jìn)皮層組織[30]，莖稈內(nèi)部測(cè)得高濃度CO2(數(shù)據(jù)未顯示)，這與ZACHARIAH等[33]對(duì)竹腔中空部具高濃度CO2和氣體正壓的研究結(jié)果相一致。表明莖稈處于高CO2低氧氣(O2)環(huán)境，這與C4植物維管束細(xì)胞所處環(huán)境類似[6,34]，PEPC在高CO2環(huán)境下往往活性更強(qiáng)[35]，莖稈內(nèi)部組織呼吸作用所產(chǎn)生的CO2被其羧化吸收重新固定。一方面避免了呼吸碳外排損耗，碳利用更加節(jié)約成本[5,34,36]；另一方面，其二次積累產(chǎn)生的糖類支持莖稈進(jìn)行快速生長(zhǎng)，釋放的O2在一定程度上緩解了莖稈組織內(nèi)部缺氧狀態(tài)和潛在酸化威脅[37]，毛竹莖稈這種特殊固碳機(jī)制可能是其能進(jìn)行快速生長(zhǎng)的重要原因之一。

綜上所述，毛竹快速生長(zhǎng)期莖稈主要以C4途徑固定CO2，NADP-ME和NAD-ME型是莖稈進(jìn)行C4途徑的主要通路；莖稈C4途徑主要用于竹腔內(nèi)部高濃度CO2再固定，形成的碳水化合物被莖稈快速生長(zhǎng)再利用，這在一定程度上減少了自身碳損耗，為進(jìn)一步解析毛竹莖稈快速生長(zhǎng)機(jī)制提供理論依據(jù)。