李敏，李婷婷，彭湃，王恩彪，孟垚，李彥成，侯欣園，楊思宇，魏小娜＊

（1. 遼寧石油化工大學，遼寧 撫順 113001； 2. 沈陽化工研究院有限公司，遼寧 沈陽 110021）

據統(tǒng)計，全世界每年進入環(huán)境的石油烴累計約800 萬t，大量石油烴最終歸口于土壤，其帶來的土壤污染問題日益突出。因此，石油烴污染土壤修復備受關注[1]。

微生物修復技術不會引起土壤結構改變和二次污染，被廣泛應用于含油土壤的修復[2]。但是，單一菌株降解效果差，且降解速率隨著時間延長不斷降低。構建復合菌群可利用不同菌株的協(xié)同作用，獲得較好的石油烴降解效果[3]。然而以游離菌形式進入土壤的大部分外源降解菌易受土壤微環(huán)境變化、污染物本身的影響，不易定殖，難以達到預期效果。微生物固定化技術通過將微生物固定在相應的載體上，使微生物在適宜條件下能夠快速、大量增殖并保持生物活性[4]。選擇適宜的固定化載體還可對土壤產生一定的保水作用，提高土壤營養(yǎng)物質含量，提高微生物對有機質、全氮和速效磷的利用率[5]。

本研究考察了篩選出的3 株石油烴降解菌去除石油烴的性能，采用吸附法制備固定化菌劑，比較了降解菌不同引入方式對污染物的去除性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 污染物

所用石油為大慶油田原油，密度為0.858 g·cm-3（20 ℃），凝固點為25.6 ℃，黏度為20.9 mPa·s（50 ℃），該石油中飽和烴、芳香烴和膠質瀝青質所占比例分別為60.5%、33.5%和6.0%。

1.1.2 供試土壤

土壤取自遼寧省彰武縣無污染的土壤，采集20～40 cm 土層樣品，經風干、碾碎，去除殘根等雜質，過2 mm 篩，后續(xù)用于微生物修復實驗。土壤的理化性質見表1。

石油烴污染土壤制備：取石油50 g 溶解于500 mL 丙酮，分散均勻后，邊攪拌邊添加到1 000 g土壤中；25 ℃避光條件下通風老化，每日早晚各攪拌一次；待丙酮揮發(fā)完全后繼續(xù)通風老化10 d，進行滅菌處理，初始石油烴質量分數為44.32 g·kg-1，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 為0.5 g·L-1，CaCl2為0.02 g·L-1，KH2PO4為1.0 g·L-1，NH4Cl 為2.0 g·L-1，FeCl3為0.05 g·L-1，pH=7。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨為10 g·L-1，酵母膏為5 g·L-1，氯化鈉為10 g·L-1，瓊脂粉為15 g·L-1， pH=7.2，121℃滅菌30 min。

1.1.4 供試菌株

采用前期實驗從油田含油污泥中篩選出的C3、C4、C5 3 株具有石油烴降解性能的菌株作為供試菌株，經16S rDNA 序列與Gene Bank 中已知序列進行比對，并結合生理生化實驗結果，確定 C3 為Pseudomonas putida ， C4 為Acinetobacter calcoaceticus，C5 為Sphingomonas sp.。

1.2 實驗方法

1.2.1 原油降解率測定

按正交優(yōu)化條件下的最佳接種比例將3 株單菌的菌懸液進行混合得復合菌劑。將活化至對數生長期的單菌株和復合菌懸液（約109 cfu·mL-1）2 mL接入100 mL 含0.5%石油烴的無機鹽培養(yǎng)基中，以不接菌的100 mL 含0.5%石油烴的無機鹽培養(yǎng)基作為對照，于30 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩搖床分別培養(yǎng)28 d。用三氯甲烷萃取培養(yǎng)基中的殘余油分，采用紅外分光光度法測定石油烴質量分數。細菌生長以波長600 nm 處的濁度OD600 表示。每個處理設置3 個重復。

1.2.2 固定化菌劑制備

取2.0 g 粒徑為0.25 mm 的生物炭作為載體，高壓滅菌后加入到100 mL LB 培養(yǎng)基中，接入6 mL復合菌懸液，30 ℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)36 h，離心得到的菌體用生理鹽水洗滌2 次，即得固定化菌劑[6]。

1.2.3 不同菌劑加入方式對含油土壤的修復

稱取1 kg 經過滅菌處理的石油烴污染土于花盆（直徑 18 cm、高 25 cm）中，保持土壤35%的濕度。試驗共設5 組處理：滅菌污染土（CK）、添加生物炭（BC）、添加游離復合菌劑（TB）、添加固定化菌劑（CTB）、添加游離復合菌+生物炭（TB+BC），其中游離復合菌和固定化菌劑含同等生物量（約3×109～8×109cfu·g-1），每個添加生物炭的處理生物炭添加量相同，每個處理設置3 個平行。分別于第 0、7、14、21、28 天進行取土樣，測定土壤中石油烴質量分數，試驗結束時測定土壤中的微生物量。

1.3 測試方法

采用梯度稀釋法對固定化菌劑和游離復合菌劑生物量進行測定，具體方法為：將1.0 g 固定化菌劑加入錐形瓶中，加入100 mL 無菌水，180 r·min-1培養(yǎng)30 min。取菌液1 mL 進行梯度稀釋后，進行涂布平板計數。游離復合菌劑培養(yǎng)液中細菌數量的確定亦取1 mL 生長至對數期的菌液進行梯度稀釋，涂布平板計數[7]。計算1 mL 游離微生物菌液與1 g 固定化菌劑數量之間的關系[8]。

采用柱層析法分離石油烴族組分[9]，采用紅外分光測油儀測定分離出的族組分含量。

2 結果與討論

2.1 菌株的生長曲線及石油烴降解性能

如圖1 所示，在發(fā)酵前期，發(fā)酵液中石油烴的質量分數隨著菌體密度的增加而逐步降低。菌株C3的對數生長期為0～16 d，C4 的對數生長期為0～18 d，C5 的對數生長期為0～14 d。培養(yǎng)14 d 時，C3、C4、C5和復合菌石油烴降解率分別為30.58%、35.76%、29.45%、42.73%。菌株進入凋亡期后，對培養(yǎng)基中的石油烴降解速率放緩。培養(yǎng)28 d 時，C3、C4、C5 和復合菌對石油烴的降解率分別為45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。結果表明，3 株菌均可以石油烴作為唯一碳源和能源生長，對數生長期石油烴去除率與菌體生長密度呈正相關，前14 d 對石油烴的降解能力復合菌＞C4＞ C3＞C5。14～28 d 期間，C3、C4對石油烴的降解率僅增加14.23%和12.25 %，C5 和復合菌對石油烴的降解率增加了24.45%和37.00%。

圖1 石油烴降解菌生長曲線及石油烴殘留率變化

通過降解菌對石油烴不同組分的去除率（圖2）分析，可見C3、C4 對飽和烴的去除率高于對芳香烴的去除率，C5 對芳香烴的利用能力要優(yōu)于C3、C4，對烷烴的去除率在3 株菌種中最低。復合菌劑對飽和烴和芳香烴的去除率分別達到 84.93%和82.08%。這一現象可能與菌種對石油烴不同組分的選擇性降解有關。如Pseudomonas細菌可利用石油烴各組分，而Acinetobacter對石油組分的降解能力為烷烴＞環(huán)烷烴＞芳香烴[10]，Sphingomonas則被認為對多種芳香族化合物具有高效降解能力[11]。通過對3 株菌的復配對石油烴各組分去除具有協(xié)同的效果，可大大提高石油烴去除率。

圖2 石油烴降解菌生長曲線及石油烴殘留率變化

2.2 不同處理石油烴降解率變化

含油土壤修復過程中石油烴降解率變化如圖3所示。修復結束后，各處理石油烴平均降解率從高到低依次為CTB＞TB+BC＞TB＞BC＞CK。固定化復合菌對石油烴的去除率為78.32%，遠高于其他處理。游離復合菌對石油烴平均降解率僅為45.81%，而在其生物量相當的情況在原油降解試驗中游離復合菌對石油降解率達到79.73%，這是因為原油降解在理想的培養(yǎng)條件下進行，且石油烴含量相對較低，而土壤環(huán)境要復雜的多，石油烴易吸附于土壤顆粒上導致其生物可給性差。CK 組最終石油烴去除率為2.96%，可能源于某些組分的揮發(fā)。對比TB+BC、TB、BC 3 組處理可見，復合菌和生物炭的簡單混合可在一定程度上提高石油烴的降解率，且其降解率要高于TB 和BC 組降解率之和，說明TB 和BC 聯(lián)用對石油烴的去除具有協(xié)同效應，高于TB 和CK 的2 個對照組，它們的石油烴降解率為分別為46.81%、2.96%。固定化復合菌劑之所以能更好地促進石油烴降解，是由于生物炭在吸附大量菌體的同時，石油烴被吸附在生物炭的孔隙中，增加了石油烴降解菌與石油烴的接觸，且生物炭表面的官能團，易解碳源和氮源有助于增強降解菌活性，進而提高石油烴降解率[12-13]。

圖3 修復過程中石油烴降解率隨時間變化

2.3 微生物數量

修復結束后各處理土壤微生物量如圖4 所示，土壤樣品中微生物數量由大到小順序依次為CTB＞ TB+BC＞ TB。這說明，在修復石油烴污染土過程中，各處理石油烴降解菌株均能夠在污染土壤中有效定殖。其中 CTB 處理組微生物數量為7.2×1010cfu·g-1，比初始增加了1 個數量級，TB 處理微生物數量較初始降低了1 個數量級，TB+BC 處理較初始略有降低。這說明生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，以固定化微生物方式加入土壤對降解菌的數量增加最為有利。這可能是由于以生物炭作為載體為降解菌提供了適宜的生存環(huán)境，減少土壤中石油烴對微生物細胞的毒害作用[14-15]，從而有助于石油烴降解菌株的定殖和石油烴的降解。

圖4 修復結束后土壤微生物數量

3 結論

3 株石油烴降解菌株均能以石油烴為唯一碳源和能源生長， 30 ℃培養(yǎng)28 d 后，C3、C4、C5 和復合菌對石油烴的降解率分別為45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。C3、C4 對飽和烴的去除能力較強，C5 對芳香烴的去除能力較強，3 株菌復配后的復合菌對石油烴各組分的去除具有協(xié)同效果。

生物炭與復合菌聯(lián)用對石油烴的去除具有協(xié)同效應，生物炭固定化復合菌對石油烴污染土壤修復效果最好，修復28 d 對石油烴的去除率為78.32%。

修復結束后，不同微生物添加方式下土壤中微生物數量表現出差異性，由大到小依次為CTB＞ TB+BC＞ TB。生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，其中生物炭作為固定化載體加入土壤對降解菌的數量增加最為有利。