張泓嬌，王小梅，王雅光，田鶴,穆長征

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

糖尿病嚴(yán)重危害著人們的健康，其中2型糖尿病(type 2 diabete，T2DM)患者居多[1]。肝損傷是糖尿病并發(fā)癥之一[2]。T2DM患者由于高血糖癥出現(xiàn)，導(dǎo)致蛋白功能喪失，進(jìn)而使肝臟氧化損傷。轉(zhuǎn)氨酶升高是肝臟損傷的判斷指標(biāo)之一，肝臟中最常見的轉(zhuǎn)氨酶是丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine transferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)；已糖激酶(hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是調(diào)控糖酵解的酶，糖酵解是維持血糖穩(wěn)定的重要因素，HK、PK升高會導(dǎo)致血糖升高，血糖升高會使炎癥標(biāo)志物升高，最終使活性氧(ROS)升高。丙二醛(malondialdehyde，MDA)作為氧化物的代表，可損傷肝細(xì)胞膜以及線粒體膜，從而損傷肝細(xì)胞。肝細(xì)胞損傷后，有大量的細(xì)胞因子產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)等。

生長分化因子-15[3](growth differentiation factor-15，GDF-15)是一種氧化應(yīng)激蛋白。在正常狀況下，GDF-15大量表達(dá)在胎盤及前列腺等少數(shù)的組織。在腫瘤、炎癥、心血管疾病以及外傷等各種應(yīng)激狀態(tài)下，GDF-15會大量表達(dá)[4]。目前，有實(shí)驗(yàn)證明它是肝臟損傷的新型標(biāo)志物，并且通過免疫抑制、抗凋亡、抗炎和促進(jìn)氧化代謝等方面對肝臟起到保護(hù)作用[5]。臨床研究報(bào)道血清中GDF-15水平可作為一個(gè)有效的生物標(biāo)志物，用于評估肝臟纖維化和慢性肝病的嚴(yán)重程度[6]。本文將通過炎癥因子的檢測等方法進(jìn)一步探討GDF-15可能對糖尿病誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 模型建立及分組

C57BL/6J雄性小鼠(4～8周齡)60只(錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重18～22 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，其余50只小鼠高脂飲食喂養(yǎng)2 w，腹腔注射STZ按(40 mg/kg體重)，每天監(jiān)測血糖，當(dāng)小鼠空腹血糖達(dá)到(≥12 mmol/L)時(shí)，為造模成功[7]。按體重選取狀態(tài)較好的小鼠30只隨機(jī)分為3組，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)30 d，具體分組及處理方法，見表1。

表1 動物分組及處理因素

1.2 取材及標(biāo)本制備

小鼠眼眶取血，EP管收集血液，4 ℃冰箱靜止2 h，低溫離心取上清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取血后小鼠灌流，立即取出肝組織，一部分稱重-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；另一部分修剪? cm3小塊，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，用于HE和免疫組織化學(xué)染色。

1.3 血糖和體重監(jiān)測

每天監(jiān)測小鼠空腹血糖和體重并做記錄，取體重和血糖變化最大的幾天(第1、3、7、14、30天)作為血糖和體重變化依據(jù)。

1.4 血清中ALT和AST含量的測定

取-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆玫难?，按照試劑盒說明書進(jìn)行ALT和AST水平的測定。

1.5 肝組織中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK的測定

取各組小鼠凍存的肝組織40 mg，按肝組織重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入360 mL的生理鹽水，制成勻漿，4 ℃離心10 min，取上清即為10%的肝勻漿液，將其分成兩份，一份用于檢測TG、TC、SOD、MDA值；另一份用生理鹽水1∶9比例稀釋成1%肝組織勻漿液，測定HK、PK酶的活力，卡馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白濃度。

1.6 ELISA檢測血清和肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

取-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆玫难搴蛢龃娴母谓M織，ELISA檢測血清和肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，具體檢測方法按試劑說明書操作。

1.7 HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變

石蠟切片二甲苯脫臘，梯度酒精浸水，蘇木素伊紅染色，脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)改變并攝像。

1.8 免疫組化檢測肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)

采用二步法 DAB 顯色檢測。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，其中一抗稀釋度為1∶200，以已知陽性片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.9 Western Blot方法檢測肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)

取凍存的肝組織，組織裂解，BCA法測定蛋白濃度，制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗，4 ℃孵育過夜，充分洗膜后，室溫下二抗孵育 1 h，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并用 Image J軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以目的蛋白與β-actin相對表達(dá)量表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重檢測結(jié)果

各組小鼠體重檢測結(jié)果：正常組小鼠體重隨飼養(yǎng)時(shí)間增加；與正常組比較，模型組和PBS組小鼠體重隨時(shí)間明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠體重隨時(shí)間增加明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.2 各組小鼠血糖檢測結(jié)果

各組小鼠血糖檢測結(jié)果：正常組小鼠血糖趨于穩(wěn)定狀態(tài)；與正常組比較，模型組和PBS組小鼠血糖隨時(shí)間明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠血糖隨時(shí)間增加明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表2 各組小鼠體重的變化

表3 各組小鼠血糖的變化

2.3 各組小鼠血清中ALT和AST檢測結(jié)果

各組小鼠血清中ALT和AST檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠血清中ALT和AST明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠血清中ALT和AST明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠血清中ALT和AST的變化

2.4 各組小鼠肝組織中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK檢測結(jié)果

各組小鼠肝組織中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠肝組織中TG、TC、MDA明顯增加，SOD、HK、PK明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠肝組織中TG、TC、MDA明顯降低，SOD、HK、PK明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

2.5 各組小鼠HE染色結(jié)果

各組小鼠HE染色結(jié)果見圖1。正常組肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無病理改變；模型組和PBS組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大量脂肪空泡，提示糖尿病小鼠肝細(xì)胞中脂肪沉積；GDF-15組肝細(xì)胞中脂肪空泡明顯減少。

2.6 各組小鼠血清和肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6檢測結(jié)果

各組小鼠肝組織與血清中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠肝組織與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠肝組織與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表6～7。

2.7 各組小鼠免疫組化染色結(jié)果

各組小鼠免疫組化染色結(jié)果見圖2～4。正常組TNF-α、IL-1β、IL-6在肝血竇低表達(dá)；模型組和PBS組TNF-α、IL-1β、IL-6在肝細(xì)胞胞質(zhì)高表達(dá)；GDF-15組TNF-α在肝血竇低表達(dá)，肝細(xì)胞胞質(zhì)中未見明顯表達(dá)，IL-1β、IL-6在肝細(xì)胞胞質(zhì)低表達(dá)。

表5 各組小鼠肝組織中TG、TC、MDA、SOD、HK、PK的變化

A代表正常組：肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰正常；B代表模型組：肝細(xì)胞內(nèi)見大量脂肪空泡；C代表PBS組：肝細(xì)胞內(nèi)見較多脂肪空泡；D代表GDF-15組：肝細(xì)胞內(nèi)見極少量脂肪空泡

表6 各組小鼠肝組織中促炎因子的變化

表7 各組小鼠血清中促炎因子的變化

A代表正常組，TNF-α在肝血竇中低表達(dá)；B代表模型組，TNF-α在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量表達(dá)；C代表PBS組，TNF-α在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)；D代表GDF-15組，TNF-α在肝血竇中少量表達(dá)

A代表正常組，IL-6在肝血竇中低表達(dá)；B代表模型組，IL-6在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量表達(dá)；C代表PBS組，IL-6在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)；D代表GDF-15組，IL-6在肝血竇中有表達(dá)，在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)

2.8 各組小鼠Western Blot檢測結(jié)果

各組小鼠Western Blot檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5、表8。

圖5 各組小鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

組 別TNF-α/β-actinIL-1β/β-actinIL-6/β-actin正常組0.33±0.020.08±0.010.13±0.01模型組1.24±0.14**0.52±0.04**0.44±0.05**PBS組 1.12±0.08**0.43±0.03**0.32±0.03**GDF-15組0.54±0.03##0.14±0.01##0.23±0.02##

3 討 論

糖尿病肝損傷是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。對于T2DM的發(fā)病機(jī)制，目前還未見明確的闡述，主要涉及以下幾個(gè)方面，如：糖脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)[8-10]等等。研究顯示，在糖尿病以及并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用的是炎癥反應(yīng)。當(dāng)TNF-α、IL -1β、IL-6 等炎癥細(xì)胞因子大量釋放時(shí)，可導(dǎo)致糖尿病肝損傷加重，可由非酒精性脂肪肝病發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎[11]。

轉(zhuǎn)化生長因子GDF-15在體內(nèi)有廣泛的表達(dá)，其主要的分泌部位在肝臟和脂肪組織。有研究表明，GDF-15能使高脂飲食的小鼠體內(nèi)脂肪含量降低[12]，同時(shí)可使機(jī)體能量消耗水平增加；還可通過抑制巨噬細(xì)胞活化減少炎癥的發(fā)生。機(jī)體炎癥反應(yīng)時(shí)GDF-15水平會有代償性增高，推測GDF-15可能對機(jī)體具有一定保護(hù)作用[5]1-5。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠糖尿病模型，就有關(guān)GDF-15對糖尿病小鼠肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了初步探索研究。

ALT和AST可作為肝細(xì)胞損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。本實(shí)驗(yàn)血清中ALT、AST的檢測結(jié)果顯示，模型組明顯升高，GDF-15組明顯下降，說明GDF-15可明顯改善糖尿病小鼠的肝功能。肝組織中糖尿病脂質(zhì)代謝指標(biāo)TG、TC的檢測結(jié)果顯示：模型組明顯升高，GDF-15組明顯下降，說明GDF-15可改善糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝。HK、PK是調(diào)控糖酵解的一種酶，肝組織中HK、PK的檢測結(jié)果顯示，模型組明顯降低，而GDF-15組明顯上升，說明GDF-15能維持糖尿病小鼠血糖的相對穩(wěn)定。糖尿病小鼠抗氧化指標(biāo)SOD、MDA的檢測結(jié)果顯示，模型組SOD表達(dá)明顯降低而MDA表達(dá)明顯升高，GDF-15組SOD表達(dá)明顯升高而MDA表達(dá)明顯降低，表明GDF-15可通過提高機(jī)體抗氧化來保護(hù)肝臟。

在各種促炎癥因子中，TNF-α是最重要的促炎介質(zhì)之一，在胰島素抵抗的發(fā)生和T2DM的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。TNF-α主要產(chǎn)生于脂肪細(xì)胞和(或)外周組織，通過參與產(chǎn)生ROS和激活各種轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的通路，誘導(dǎo)組織特異性炎癥。TNF-α水平升高誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞和外周組織的胰島素抵抗，通過絲氨酸磷酸化削弱胰島素信號，從而導(dǎo)致T2DM的發(fā)展。有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，通過抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來預(yù)防1型和2型糖尿病。本實(shí)驗(yàn)各組小鼠血清和肝組織中TNF-α、IL-6及IL-1β檢測結(jié)果顯示，模型組促炎癥因子表達(dá)明顯上升，GDF-15組促炎癥因子表達(dá)明顯下降；免疫組織化學(xué)染色和Western Bolt檢測肝組織中NF-α、IL-6及IL-1β表達(dá)結(jié)果顯示：模型組處于高表達(dá)，GDF-15組處于低表達(dá)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明GDF-15能抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。有關(guān)GDF-15介導(dǎo)改善糖尿病小鼠肝損傷的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究來闡明。