羅建波，李軍暉，王海江，周小玉，曾 濤，周 佳，朱獻軍

（1. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，成都 610212；2. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院人類疾病基因研究四川省重點實驗室，成都 610072）

為給疾病的治療制定科學的診療方案，人類疾病動物模型常應用于前期的理論研究。利用高脂日糧中各養(yǎng)分的缺乏、過量以及比例失衡，觀察疾病發(fā)展過程，以此獲得基礎數據[1]。成熟的動物模型表現的疾病發(fā)生過程與人類相似，具備實驗動物死亡率低、操作簡單、可重復性強、成本低廉等特點[2]。近年來，高脂飼料配方被廣泛應用于制作代謝性疾病動物模型，并取得了大量的研究成果。為給廣大科研人員研究提供理論和實踐依據，現對常見高脂日糧誘導的代謝性疾病模型及其作用方式進行綜述。

1 代謝性疾病模型

1.1 高脂血癥

高脂血癥是動脈粥樣硬化、腦卒中和糖尿病等疾病的主要誘因，常表現為血液中三酰甘油和膽固醇水平異常[3]。誘導該模型的飼料主要以基礎料+ 膽固醇+ 豬油為主。由于大鼠無膽囊結構，缺乏對飼料中膽固醇等成分的消化能力，因此用大鼠建立的高脂血癥疾病模型中，丙基硫氧嘧啶(0.2%)常被添加進造模飼料配方[4]。血清中的總膽固醇、三酰甘油和脂蛋白水平等指標變化常被用來反映模型建立情況[5-9]（表1）。血液中的膽固醇和三酰甘油需要以脂蛋白的形式運輸到體內組織進行代謝。高熱量和高膽固醇日糧能夠提高實驗動物肝臟組織中膽固醇的含量，影響脂蛋白受體合成及其表面受體活性，導致血液中膽固醇和三酰甘油的轉運受阻而不斷在血液中蓄積。

表 1 高脂日糧誘導下的高脂血癥模型Table 1 High-fat diet induced hyperlipidemia animal models

1.2 動脈粥樣硬化

當機體發(fā)生代謝異常時，動脈內膜脂質沉積，纖維基質成分和平滑肌的細胞增殖引起內膜灶性纖維性增厚及粥樣斑塊形成，使動脈壁變厚，管腔狹窄，最終導致動脈粥樣硬化形成[10]。誘導該模型的飼料以基礎料+膽固醇+豬油+糖為主[11-14]（表2），并在動物實驗前期灌胃維生素D3（7 ×105U/kg）。研究認為，大劑量維生素D3 能夠引起動脈鈣超負荷，使血漿脂蛋白易沉積在內皮下層，動脈發(fā)生鈣化，增加脂質對內皮的損傷作用[15]。動脈粥樣硬化是發(fā)生在動脈壁的一種慢性疾病過程，主要由于炎性細胞的聚集以及炎性因子的釋放引起[16]。在動脈粥樣硬化發(fā)病初期，血液中的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）與單核細胞在動脈中內皮細胞受損的情況下直接進入動脈壁，血液中的LDL因被氧化，不斷引起單核細胞趨化，同時誘導單核細胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）產生，促使內膜下的單核-巨噬細胞分化成泡沫細胞，疾病不斷發(fā)展。在核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）途徑介導下生成的炎性因子、抗氧化酶和黏附分子等進一步誘發(fā)動脈粥樣硬化形成與發(fā)展[17]。

1.3 2 型糖尿病

動物機體自身雖然能夠產生胰島素，但分泌量相對不足，引發(fā)血糖升高，即產生2 型糖尿病。誘導該模型的飼料以基礎料+膽固醇+豬油為主；為誘導模型的形成，實驗通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)2 個月后，采用腹腔注射的方式，用劑量為30 mg/kg 的亞致病鏈脲佐菌素直接破壞胰島β 細胞，導致胰島素分泌異常。2 型糖尿病模型除監(jiān)測血清中總膽固醇、脂類和脂蛋白等指標外，還增加了氧化應激指標，例如丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性等，并輔以口服葡萄糖耐量試驗、肝臟和胰腺切片法觀察模型建立情況[18-20]（表3）。研究認為，由氧化應激引起的β 細胞功能受損是引發(fā)2 型糖尿病的核心。在機體發(fā)生氧化應激后，促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平失衡，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活化作用增強，β 細胞凋亡數量上升[21]。同時，在超量自由基作用下，c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路被活化，胰十二指腸同源框因子-1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）活性降低，誘發(fā)細胞核內的PDX-1 移至細胞質，使PDX-1 與胰島素啟動子不能結合，降低胰島素基因表達和分泌量，動物體內血糖水平維持功能下降，導致2 型糖尿病發(fā)生[22]。

表 2 高脂日糧誘導的動物動脈粥樣硬化模型Table 2 High-fat diet induced atherosclerosis animal models

表 3 高脂日糧誘導的動物2 型糖尿病模型Table 3 High-fat diet inducesd type 2 diabetes animal models

1.4 胰島素抵抗

研究指出，受體部位對體內外胰島素的敏感性下降是直接造成胰島素抵抗的核心機制。臨床研究認為，胰島素抵抗容易引起糖尿病和動脈粥樣疾病的發(fā)生率升高，同時與肥胖和心血管等疾病有密切聯(lián)系[23]。誘導該模型的飼料以基礎料+膽固醇+豬油+糖為主，并可通過增加糖分含量縮短模型建立周期[24-26]（表4）；高脂飼料在制備環(huán)節(jié)中，蛋白質、脂肪與碳水化合物充分混合加熱，導致高級糖化產物（advanced glycation end-products，AGEs）的形成 , 更加有利于該疾病模型的建立[27]。研究認為，胰島素抵抗的發(fā)生主要是由于長期血液中高水平的游離脂肪酸（free fat acid，FFA）引起內質網應激、自由基侵襲、細胞凋亡和炎性反應，使正常的胰島素信號轉導不能實現，引起胰島素抵抗發(fā)生；其中，信號途徑c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核因子-κB 激酶抑制劑/核轉錄因子-κB（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase/nuclear transcription factor-κB，IKK/NF-κB）之間交互作用造成的損傷是FFA 誘發(fā)胰島素抵抗的主要誘因[28]。血液FFA可使胰島素受體的結構因發(fā)生磷酸化而改變，影響正常的酪氨酸磷酸化和磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3Ks）活性，胰島素信號通路受阻。此外，活化后的絲氨酸/ 蘇氨酸激酶（serine/threonine kinases，AKT）可以通過調節(jié)包括糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）在內的一系列下游分子而增加糖原生成，同時叉頭框轉錄因子O 亞族1（forkhead box O1，FoxO1）磷酸化后導致自身功能異常，影響磷酸烯醇式丙酮酸激酶（phosphoenol- pyruvatecarboxy-kinase 1，PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose 6 phosphatase，G6Pase）在體內的糖異生作用，增加胰島素抵抗的發(fā)生風險[29]。

表 4 高脂日糧誘導的動物胰島素抵抗模型Table 4 High-fat diet induced insulin resistance animal models

1.5 肥胖

動物攝入熱量高于消耗熱量，即造成體內脂肪過量、分布異常，引發(fā)肥胖癥的發(fā)生[30]，其主要特征為血脂水平的提高以及體質量、腹腔脂肪質量、Lee’s 指數改變等[31]，可增加其他代謝性疾病的發(fā)病率[32]。肥胖疾病模型常選擇SD 大鼠、C57BL/6J 小鼠、ICR 小鼠和KM 小鼠[32]。誘導該模型的飼料以基礎料+豬油為主，模型建立時間為6～8 周[31,33-34]（表5）。研究發(fā)現，在高脂或高脂高糖飼料造模結果中，由于部分動物的采食狀況存在差異，影響營養(yǎng)性肥胖模型的建立，因此，動物樣本需要加倍，防止因實驗動物數量不足而影響下一步實驗的正常進行[35]。高脂飼料誘導后，過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors α，PPARα）和 PPARγ 表達水平上調，導致脂蛋白脂肪酶（lipoprtein lipase，LPL）活性提高，三酰甘油解離為FFA 且被脂肪組織大量吸收；在脂肪組織二酰甘油的酰基轉移酶（diacylglycerol acyl-transferase，DGAT）表達上調的情況下，機體中三酰甘油重新貯存。固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c（sterol-regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）在調節(jié)相關基因表達中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現，高脂飼料通過破壞體內胰島素和葡萄糖平衡，激活PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1（mammalian target of rapamycin 1，mTORC1）途徑，上調脂肪代謝和葡萄糖代謝調控因子SREBP-1c及其下游脂肪合成相關靶基因如低密度脂蛋白受體基因（low density lipoprotein receptor，LDLR）、乙酰輔A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）等的表達，引起糖脂代謝紊亂和脂肪組織的異位沉積[36]。另一方面，脂肪分解酶如脂肪三酰甘油脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、脂肪組織激素敏感脂酶（hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL）及三酰甘油水解酶（triacylglycerol hydrolase，TGH）表達下調，引起動物體質增加、腹腔脂肪增多等肥胖疾病的典型癥狀[32]。

表 5 高脂日糧誘導下的動物肥胖模型Table 5 High-fat diet induced obesity animal models

1.6 非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種以非飲酒方式作用下引起的肝細胞病變，高水平的血脂及脂肪過量沉積和胰島素敏感性降低都可誘發(fā)NAFLD 的發(fā)生[37]。誘導該模型的飼料以基礎料+膽固醇+膽鹽+豬油+糖為主[38-41]（表6），除血清常規(guī)指標外，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子-β1 指標也常用于檢測模型建立情況。研究發(fā)現，高脂日糧誘發(fā)NAFLD 主要是依靠兩條途徑調節(jié)細胞凋亡：（1）脂肪代謝紊亂。高脂日糧導致肝臟細胞內FFA 持續(xù)積累，引起肝臟中脂肪代謝平衡破壞，降低肝臟組織中脂肪酸β 氧化能力，同時引起合成或分泌VLDL 的能力下降，減少三酰甘油轉運出肝臟，導致細胞脂肪變性，發(fā)生脂肪肝病變，破壞細胞線粒體的超微結構，造成呼吸鏈因磷酸化發(fā)生障礙，電子傳遞受到干擾，分子氧因獲得電子而攻擊機體正常細胞，JNK/Bcl-2 信號轉導通路被激活，細胞走向凋亡。（2）胰島素通路受阻。高脂日糧不斷刺激機體分泌胰島素，使其受體底物發(fā)生磷酸化，結構發(fā)生改變，PI3K 活性下降，導致胰島素敏感性下降，直接引發(fā)線粒體依賴途徑下的細胞凋亡[42-43]。

2 誘導建模的高脂飼料成分

建模飼料以基礎日糧和高熱量成分為主要構成，輔以添加幫助脂肪消化和破壞動物特定組織的額外成分，通過調整各成分比例來滿足不同的實驗需求。

2.1 基礎日糧

基礎日糧含有促進動物正常生長必需的營養(yǎng)物質，滿足動物營養(yǎng)需求，其所含的營養(yǎng)濃度需要整體考慮營養(yǎng)參數和各成分添加比例，使高脂日糧中各營養(yǎng)成分滿足動物需要。一般情況下，酪蛋白、蛋黃粉和奶粉可用于補充高脂日糧中的蛋白質和氨基酸，磷酸氫鈣和石粉用于補足動物鈣和磷等需要，維生素（礦物質）添加劑用于補充實驗動物的維生素（微量元素）需要，不足部分可用玉米淀粉填充。

2.2 膽固醇和膽鹽

在模型飼料中加入膽固醇，提高動物體內該物質水平，引發(fā)炎性反應和氧化應激，促進疾病的形成。因此，為構建動物模型，膽固醇是模型飼料的重要成分[4]。需要注意的是，膽固醇添加比例過高容易導致腹瀉，造成動物死亡，而比例太低時造模周期長，不易形成病變，故常用比例建議為5%以下。實驗研究發(fā)現，飼料中的膽鹽雖然可以幫助促進脂肪在體內的吸收利用，但是膽鹽味苦，會嚴重影響動物食欲，且易引起體質量下降；當膽固醇添加量大于2%時，考慮加入膽鹽，一般添加比例為0.5%。值得注意的是，在小鼠模型飼料中，考慮到小鼠對膽固醇的消化能力較弱，常在膽固醇含量為1%時就加入一定比例的膽鹽，以幫助建立動脈粥樣硬化模型。動物實驗過程中，總膽固醇及LDL水平受飼料中膽固醇及膽鹽的影響，其中飼料成分中膽固醇的作用更大[4]。

2.3 糖類

在高脂高糖飼料配方中，蔗糖和果糖是模型誘導成功的關鍵成分。果糖和葡萄糖是具有相同分子式，而結構上有較大差異的兩種化合物，可通過有機反應相互結合生成蔗糖。蔗糖是由葡萄糖與果糖中功能基團通過縮合脫水作用生成，其中蔗糖中的果糖成分在高糖飼料誘導的胰島素抵抗中起主要作用。添加糖類一方面可幫助誘導疾病的發(fā)生和發(fā)展，另一方面則通過改善日糧的適口性，增加動物的采食；一般添加比例為20%以下，添加量過高不利于飼料加工成型，同時糖類成分過多會破壞配方設計中營養(yǎng)的整體平衡。有研究者認為，長時間采食高糖類（蔗糖或果糖）物質可以顯著促進布勞特菌、羅伊乳桿菌和脆弱擬桿菌增殖，抑制糞腸腸球菌和黃色瘤胃球菌增殖，從而造成腸道菌群紊亂，導致腸道物理屏障作用削弱，提高腸道內脂多糖的含量和通透性，脂多糖通過與腸細胞中Toll 樣受體4 結合而誘發(fā)NF-κB 途徑激活，提高促炎因子的表達，誘導氧化應激的發(fā)生。此外，上調的促炎因子可以通過促進糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，導致機體對胰島素的敏感性降低，產生胰島素抵抗，激活還原型輔酶Ⅱ即煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），誘導超氧陰離子產生，使機體進一步遭受氧化損傷[44]。

2.4 脂肪

脂肪是機體重要的供能物質。飼料中脂肪的加入能夠保證能量和必需脂肪酸的供給，也可幫助溶解飼料中的脂溶性物質；然而，該物質超過動物正常需要量時，會直接導致血脂水平異常，引發(fā)心血管和肥胖等疾病，造成機體代謝異常，使自由基產生量超過機體清除能力，誘導氧化應激發(fā)生[45]。誘導疾病模型的飼料中常添加的脂肪源有豬油、棕櫚油和椰子油等，理論上飼料中脂肪含量越高越有利于疾病模型的建立，但當脂肪比例大于20% 時，加工工藝的要求會增高，不利于實驗飼料制備、儲存及定量飼喂。而且，飼料中過高比例的脂肪會直接降低動物采食量，故一般添加比例建議不高于20%[45]。

豬油是一種飽和高級脂肪酸，外形為黃色、半透明液體狀。研究認為，過量食用飽和脂肪會引發(fā)肝內三酰甘油水平升高，導致脂肪酸在肝臟中蓄積，促進膽固醇合成，誘發(fā)機體產生過量自由基，造成線粒體功能受損和胰島素抵抗[46]。棕櫚油含有豐富的棕櫚酸，飲食中高濃度的棕櫚油會對肝臟產生毒性作用，主要表現在細胞放射狀結構的喪失和細胞體積的縮小，隨即細胞遭受不可逆損傷。在哺乳動物細胞模型中，高濃度棕櫚酸會直接作用于內質網，破壞細胞器穩(wěn)態(tài)，即內質網應激[47]。中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸是椰子油中的主要脂肪形式。研究認為，與長鏈脂肪酸吸收不同的是，中鏈脂肪酸的吸收可通過腸道進入血液，而不需要膽汁酸參與，因此中鏈脂肪酸更容易被機體利用，可在維持動物體質量的基礎上，減少體內脂質的大量蓄積，讓血液生化指標保持正常水平，維持機體正常的脂質代謝[48]。

3 高脂飼料的儲存

由于造模飼料含有較高脂肪，飼料在儲存過程中易發(fā)生氧化酸敗，生成醛、酮、酮酸等物質，降低飼料的適口性和營養(yǎng)價值[49]。動物攝入氧化酸敗的飼料后，氧化產物進入細胞膜，體內吞噬細胞為消滅異物，會產生大量自由基，損害生物細胞功能，造成動物氧化應激。因此，與普通飼料相比，高脂飼料的存儲條件更為苛刻。高脂飼料一般對溫度、光線和氧氣敏感，因此飼料需采用外包裝隔絕光照，同時抽盡包裝內部空氣，并采用60Co 輻照滅菌。由于模型建立的實驗周期較長，建議以1 個月的使用量為準，分批定制造模飼料，并存儲于－4 ℃條件下；在使用前，需將帶包裝的飼料置于常溫下，達到室溫后，方可開始飼喂，以降低動物消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生風險。

4 疾病模型的評估

疾病模型的建立需要花費較長時間，也是許多研究的前期基礎工作，因此為確保實驗順利實施，從制定配方到進行動物實驗都需要嚴謹規(guī)范，并全面評估各個環(huán)節(jié)。（1）模型飼料的營養(yǎng)參數評估。在確定模型建立方向的前提下，對高脂飼料中各添加物質的功能進行綜合考量，同時對飼料中各項營養(yǎng)素的標準值進行仔細分析，從而構建營養(yǎng)過載或缺乏的動物模型配方。此外，在添加其他成分的前提下，某些營養(yǎng)素含量被稀釋，因此應該額外補足各自特定的基礎飼料營養(yǎng)成分。實驗開始前，需要按照飼料檢測標準，準確測定各項參數的實際數值，與理論值進行核對。（2）動物實驗過程的評估。模型建立前期，需要逐步添加高脂飼料，避免營養(yǎng)應激對動物造成影響。模型建立過程中，及時清除動物食槽內的剩余飼料；另外，高脂飼料由于脂肪比例較高，長期暴露空氣中容易引發(fā)酸敗變質，動物采食后易引起腹瀉，因此，加料不宜過量。模型建立后期，動物由于肥胖、高血糖和糖尿病等，會出現一系列病變，需加強對微生物的控制，減少實驗動物受其他因素的影響。（3）疾病特異性指標評估。評價模型建立效果，不能僅僅只依據動物生理生化參數是否達到要求，還要考慮疾病的進程。例如，高脂血癥和脂肪肝都能夠引起血脂升高，單從血脂指標來判斷動物疾病模型的建立狀況顯然不夠充分，需要進一步對肝臟進行病理切片，進一步明確模型階段，綜合考慮機體的整體反應。

5 小結

以基礎料+豬油+糖+膽固醇+膽酸為主要成分而配制的高脂飼料，可根據疾病模型、實驗動物種類、造模周期和營養(yǎng)需求，調整飼料中各成份的比例，同時考慮加入丙基硫氧嘧啶或注射維生素D3 等額外輔助手段，達到建立動物模型的預期。在擬定新的造模飼料配方時，可結合高脂誘導的疾病模型建立機制，參考實驗動物本身的代謝規(guī)律，考慮實驗時間和造模周期，篩選出符合自身實驗研究目的的高脂飼料配方，從而提高建模的成功率和有效性，為研究相關疾病提供理論基礎。