黃冠文，包繼文，李子揚(yáng)，張敏芳，周文彥，王 琴，倪兆慧，王 玲

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，上海200127

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及全身多個(gè)器官的自身免疫性疾病，其中狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE 最常見(jiàn)且嚴(yán)重的合并癥，50%～70%的SLE 患者會(huì)出現(xiàn)腎臟受累的臨床表現(xiàn)。盡管各種新型治療手段不斷應(yīng)用于臨床，但仍有約25%的LN 患者會(huì)進(jìn)展為終末期腎病［1］，導(dǎo)致預(yù)后不良。

LN 的病理學(xué)改變多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，如何有效評(píng)價(jià)LN 的活動(dòng)度對(duì)患者治療方案的選擇及生存預(yù)后有重大意義。腎穿刺活檢病理檢查是診斷LN 及評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)度的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其為有創(chuàng)性檢查手段，難以多次重復(fù)進(jìn)行；而臨床治療中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)LN 疾病活動(dòng)度，及時(shí)調(diào)整治療方案，對(duì)LN 患者極為重要［2］。目前用于監(jiān)測(cè)LN 疾病活動(dòng)度的指標(biāo)如尿蛋白、紅細(xì)胞沉降率、C 反應(yīng)蛋白、C3、C4、C1q 和抗雙鏈DNA 抗體（anti-double stranded DNA antibody，anti-dsDNA）等敏感度和特異度各有不同［3］，傳統(tǒng)的指標(biāo)不能特異性監(jiān)測(cè)LN 疾病活動(dòng)度，因此尋找無(wú)創(chuàng)、快捷且靈敏評(píng)價(jià)LN 活動(dòng)度的臨床指標(biāo)尤為重要。

T細(xì)胞信號(hào)異常及功能失調(diào)是SLE的重要發(fā)病機(jī)制之一［4］。 可 溶 性 白 介 素2 受 體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）是T 細(xì)胞激活的一個(gè)標(biāo)志［5-6］。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的重要效應(yīng)因子，主要由激活的T 細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［7］。研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病，如干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化癥和SLE 中血清sIL-2R 和TNF-α水平均升高［8］。然而，目前對(duì)于sIL-2R 和TNF-α 是否能用于評(píng)估LN 的疾病活動(dòng)度尚不明確。故本研究通過(guò)檢測(cè)健康人群和不同活動(dòng)度LN患者的sIL-2R和TNF-α水平并收集相關(guān)臨床指標(biāo)，探討sIL-2R和TNF-α與LN活動(dòng)度的關(guān)系，以期為臨床上LN 疾病變化監(jiān)測(cè)提供新的潛在標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為橫斷面研究。收集2018 年1 月—12 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院東院就診的LN 患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲并符合1997 年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］4 項(xiàng)及以上，且腎穿刺病理活檢證實(shí)為L(zhǎng)N 的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患惡性腫瘤患者、精神疾病患者、妊娠或哺乳期婦女。根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病 活 動(dòng) 指 數(shù)［10］（systemic lupus erythematosus disease activity index-2000，SLEDAI-2K）將LN 患者分成2 組：0～4 分為非活動(dòng)組，＞4 分為活動(dòng)組。同時(shí)選取同期在本院體檢健康者68 例為對(duì)照組。本研究獲得所有對(duì)象的知情同意，并獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 資料收集

收集患者一般資料，包括姓名、性別、年齡、身高、體質(zhì)量和血壓。收集實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，包括血常規(guī)、紅細(xì)胞沉降率、24 h 尿總蛋白（24 hours urine total protein，24h-UTP）、肝功能、腎功能、高敏C-反應(yīng)蛋白（high sensitive C-reactive protein，h-CRP）、C3、C4、抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、anti-dsDNA 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）等。

1.3 血清sIL-2R和TNF-α的水平檢測(cè)

無(wú)菌采集患者和健康者靜脈血5 mL，1 000×g 離心15 min 后吸取上層血清，分裝至離心管，-80 ℃冰箱凍存。sIL-2R 和TNF-α 均使用ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)備為美國(guó)伯騰ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，試劑由瑞士羅氏公司提供，操作嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。正態(tài)分布的定量資料采用x±s 表示，非正態(tài)分布的定量資料采用M（Q1，Q3）表示。正態(tài)分布的定量資料組間比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的定量資料則采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，分類(lèi)變量采用χ2檢驗(yàn)。用Spearman秩相關(guān)分析評(píng)價(jià)LN患者血清sIL-2R和TNF-α水平與LN活動(dòng)度及臨床指標(biāo)的相關(guān)性。經(jīng)Box-Tidwell 方法檢測(cè)連續(xù)自變量與因變量logit轉(zhuǎn)換值之間存在線性關(guān)系且自變量之間不存在多重共線性后，采用多因素Logistic 回歸分析法（基于最大似然估計(jì)的向前逐步回歸法）分析sIL-2R和TNF-α與LN活動(dòng)度之間的關(guān)系，并采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)其對(duì)預(yù)測(cè)LN 活動(dòng)度的價(jià)值。雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究共納入40 例LN 患者和68 名健康對(duì)照者。對(duì)照組平均年齡（38.6±13.1）歲，其中男17 例，女51 例；LN 組平均年齡（42.6±11.3）歲，其中男4 例，女36 例，2組間性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。和對(duì)照組相比，LN 組紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板和白蛋白較低，白細(xì)胞和血肌酐較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 對(duì)照組和LN組一般特征和臨床指標(biāo)Tab 1 General characteristics and clinical indexes of control group and LN group

2.2 LN患者血清sIL-2R和TNF-α水平分析

如圖1 所示，LN 患者的血清sIL-2R 水平［（554.0±199.0）U/mL］和TNF-α 水平［（13.6±6.1）pg/mL］顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 對(duì)照組與LN組血清sIL-2R和TNF-α水平Fig 1 Serum levels of sIL-2R and TNF-α in the control group and LN group

2.3 LN患者血清sIL-2R和TNF-α水平與病情相關(guān)性分析

如圖2 所示，sIL-2R 及TNF-α 水平與LN 患者疾病活動(dòng)度及相關(guān)臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性分析顯示，LN 患者血清sIL-2R 水平與SLEDAI-2K、24h-UTP、血肌酐、antidsDNA 和h-CRP 呈顯著正相關(guān)（均P＜0.05），和C3 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。TNF-α 水平與SLEDAI-2K、24h-UTP、血肌酐和h-CRP 呈顯著正相關(guān)（均P＜0.05），但與anti-dsDNA和C3（均P＞0.05）無(wú)明顯相關(guān)性。

圖2 LN患者血清sIL-2R和TNF-α水平與病情相關(guān)性分析Fig 2 Correlation analysis of serum sIL-2R,TNF-α and disease activity in LN patients

2.4 LN患者疾病活動(dòng)度預(yù)測(cè)分析

根據(jù)SLEDAI-2K 評(píng)分將LN 患者分為L(zhǎng)N 活動(dòng)組和LN 非活動(dòng)組，其中LN 非活動(dòng)組（SLEDAI-2K≤4）有23 例患者，LN 活動(dòng)組（SLEDAI-2K＞4）有17 例患者。LN 非活動(dòng)組和活動(dòng)組患者的年齡、性別和既往用藥差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LN 活動(dòng)組患者C3 低于非活動(dòng)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、白蛋白和Treg水平低于非活動(dòng)組，h-CRP水平高于非活動(dòng)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。LN 活動(dòng)組患者24h-UTP、肌酐、anti-dsDNA、TNF-α 和sIL-2R 水平高于非活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2 LN 患者非活動(dòng)組與活動(dòng)組的臨床資料Tab 2 Clinical data of active and non-active group in LN patients

Continued Tab

為了進(jìn)一步研究sIL-2R及TNF-α與LN疾病活動(dòng)度的關(guān)系，將LN 活動(dòng)組和非活動(dòng)組患者存在差異的指標(biāo)（肌酐、24h-UTP、C3、anti-dsDNA、TNF-α 和sIL-2R）作為自變量，活動(dòng)度指標(biāo)（SLEDAI-2K）作為因變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析（向前逐步回歸法），結(jié)果顯示sIL-2R 和anti-dsDNA 是提示LN 患者疾病活動(dòng)的預(yù)測(cè)因素（表3）。

表3 LN活動(dòng)度預(yù)測(cè)因子的Logistic分析Tab 3 Logistic analysis of predictive factors of LN activity

采用ROC 曲線對(duì)anti-dsDNA、sIL-2R 以及兩者聯(lián)合分析對(duì)LN 患者疾病活動(dòng)度的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3 所示，antidsDNA 預(yù)測(cè)LN 疾病活動(dòng)度的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.871（95%CI 0.762～0.980，P=0.000），血清sIL-2R 預(yù)測(cè)LN 疾病活動(dòng)度的AUC 為0.816（95%CI 0.684～0.948，P=0.000），anti-dsDNA 和sIL-2R 聯(lián)合預(yù)測(cè)LN 疾病活動(dòng)度的AUC 最大，為0.957（95%CI 0.899～1.000，P=0.000）。

圖3 Anti-dsDNA、sIL-2R及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)LN患者疾病活動(dòng)度的ROC曲線Fig 3 ROC curves for disease activity prediction of LN patients using antidsDNA,sIL-2R and their combination

3 討論

LN 的病理學(xué)改變多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，找到快捷且準(zhǔn)確評(píng)估LN 活動(dòng)度的臨床指標(biāo)對(duì)患者的治療及生存預(yù)后有重大意義。我們研究表明，LN 患者中血清sIL-2R 和TNF-α 水平顯著升高，并與LN 疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，sIL-2R 和anti-dsDNA 聯(lián)合可提高對(duì)LN 患者疾病活動(dòng)度預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sIL-2R 與LN 患者疾病嚴(yán)重程度及活動(dòng)度的臨床指標(biāo)相關(guān)，包括24h-UTP、antidsDNA、C3 和h-CRP。研究［11］發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和功能失調(diào)導(dǎo)致的IL-2 生成減少及sIL-2R 生成增加是SLE發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。SLE中IL-2的轉(zhuǎn)錄激活因子核因 子κB （nuclear factor-κB，NF-κB）、激 活 蛋 白-1（activator protein 1，AP-1）、活化T 細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NF-AT）和磷酸化cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic AMP response element binding protein，CREB）減少，以及轉(zhuǎn)錄抑制因子磷酸化cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)子α （cyclic AMP responsive element modulator α，CREMα）增加，可導(dǎo)致T 細(xì)胞分泌IL-2 減少［12］。IL-2 減少又可反向調(diào)節(jié)多種T 細(xì)胞，使Treg 細(xì)胞功能受損，T效應(yīng)細(xì)胞凋亡增加，增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致SLE 病情的惡化［4］。IL-2 通過(guò)結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞表面的IL-2R 發(fā)揮作用，該受體主要分布在T 細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，由α 鏈（CD25）、β 鏈（CD122）和細(xì)胞因子共用受體γ 鏈（CD132）3 個(gè)亞單位組成［13］。SLE中IL-2 與Treg 細(xì)胞上的IL-2R 結(jié)合，而后24～48 h IL-2R的α 鏈從細(xì)胞表面脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，成為sIL-2R［14］。本研究證實(shí)在LN 活動(dòng)期，患者sIL-2R 明顯升高，與SLEDAI-2K呈正相關(guān)。目前用于監(jiān)測(cè)LN活動(dòng)度的傳統(tǒng)指標(biāo)有一定的局限性。如蛋白尿并不總是與LN 疾病活動(dòng)度相關(guān)，蛋白尿的減少與腎臟炎癥的緩解并不完全一致［15］；Anti-dsDNA 在腎臟疾病暴發(fā)前滴度上升，而在疾病暴發(fā)時(shí)，其滴度可能下降［16］。我們通過(guò)預(yù)測(cè)分析顯示，相較于單個(gè)指標(biāo)，sIL-2R 和anti-dsDNA 聯(lián)合可提高對(duì)LN 患者疾病活動(dòng)度預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。另一方面，循環(huán)系統(tǒng)中的sIL-2R 可能與IL-2R 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合效應(yīng)T 細(xì)胞膜上的IL-2，使IL-2不能發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用，加重腎臟損傷；這也進(jìn)一步證實(shí)sIL-2R 在LN 的疾病進(jìn)展中具有重要作用［17-18］。臨床研究［19］也發(fā)現(xiàn)，低劑量IL-2能降低SLE患者的免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群和降低SLEDAI，從而緩解SLE患者的病情。

TNF-α 由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥等過(guò)程。SLE患者的TNF-α信號(hào)通路被激活，并通過(guò)NFκB 激活炎癥信號(hào)通路，造成局部炎癥暴發(fā)、組織損傷壞死和自身抗原暴露，介導(dǎo)了SLE 的發(fā)生和發(fā)展［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，LN 患者血清TNF-α 水平升高，活動(dòng)期和非活動(dòng)期患者TNF-α 水平具有明顯差異，且與SLEDAI-2K（r=0.561，P=0.000）和24h-UTP（r=0.427，P=0.006）呈中度正相關(guān)。既往研究［21-22］發(fā)現(xiàn)，血清高水平TNF-α 與SLE 活動(dòng)度呈正相關(guān)，且SLE 患者中TNF-α 的水平升高，同時(shí)在SLE 復(fù)發(fā)前6～12 周，TNF-α 及其受體水平升高。Idborg 等［23］證明TNF-α 和SLE 患者SLEDAI-2K 之間具有低度正相關(guān)性（r=0.32，P＜0.01）。然而，TNF-α 是否可作為L(zhǎng)N 的活動(dòng)度監(jiān)測(cè)指標(biāo)目前仍不明確。TNF-α 在腎小球屏障功能障礙及蛋白尿的發(fā)展中也起重要作用。除單核巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生TNF-α 外，TNF-α 也高表達(dá)于腎小球和腎小管細(xì)胞，LN 患者的TNF-α 升高可能有多種來(lái)源，共同破壞腎小球屏障功能，增加尿蛋白水平［20］。

既往研究［23］還發(fā)現(xiàn)，TNF-α 可作為SLE 診斷和活動(dòng)度監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，橫斷面研究顯示其與SLEDAI-2K、系統(tǒng)性狼瘡活動(dòng)問(wèn)卷 （Systemic Lupus Activity Questionnaire，SLAQ） 得分和紅斑狼瘡活動(dòng)度測(cè)定（systemic lupus activity measure，SLAM）結(jié)果呈低度正相關(guān)，然而該研究?jī)H進(jìn)行相關(guān)性分析。本研究也發(fā)現(xiàn)在LN 患者中TNF-α 與SLEDAI-2K 呈正相關(guān)，然而納入多因素Logistic 回歸分析后發(fā)現(xiàn)，TNF-α 與LN 活動(dòng)度無(wú)相關(guān)性；可能TNF-α水平受多種因素影響，其作為L(zhǎng)N 活動(dòng)度預(yù)測(cè)的特異性需進(jìn)一步證實(shí)。

本研究LN 組患者均有尿液及腎功能異常表現(xiàn)。有研究［24］表明，無(wú)明顯尿液及腎功能異常的亞臨床LN患者，其腎活檢結(jié)果仍顯示腎臟受累， 且病理類(lèi)型輕重不一，與臨床LN 患者病理改變無(wú)明顯差異。因此，探索sIL-2R和TNF-α在亞臨床LN 患者中的水平及進(jìn)一步的隨訪研究將有助于證實(shí)我們的研究結(jié)論。

綜上所述，LN患者中血清sIL-2R和TNF-α水平升高，sIL-2R 和TNF-α 水平和LN 疾病活動(dòng)相關(guān)，sIL-2R 聯(lián)合anti-dsDNA可能可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)LN患者疾病活動(dòng)度。