佟 琰，方均燕，鄧 海，宋阿會，李 璞，劉英莉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海200011

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）利用人體自身的腹膜作為透析膜，清除體內(nèi)的毒素和過多的水分［1］。溶質(zhì)通過腹膜的速度，即腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率（peritoneal solute transport rate，PSTR），是評價腹膜性能的重要指標(biāo)。臨床上常通過腹膜平衡試驗（peritoneal equilibrium test，PET）對PSTR 進(jìn)行評估，按照4 h 腹膜透析濾出液/血漿肌酐濃度比值（4h D/PCr）數(shù)值分為高轉(zhuǎn)運（0.82～1.03）、高平均轉(zhuǎn)運（0.65～0.81）、低平均轉(zhuǎn)運（0.50～0.64）和低轉(zhuǎn)運（0.34～0.49）［2-3］。腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)的患者容量清除較差，更容易出現(xiàn)水鈉潴留、超濾衰竭和腹膜纖維化等PD 相關(guān)并發(fā)癥［4-5］。上皮細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腹膜纖維化形成的重要病理生理過程［6］。在一項PD 大鼠動物模型的研究［7-8］中發(fā)現(xiàn)，腹膜纖維化早期miR-200a 的表達(dá)減少，并且miR-200a 可以通過靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白1/2 （zinc finger E-box-binding homeobox 1/2，ZEB1/2）負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的EMT。腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)與腹膜纖維化直接相關(guān)，而miR-200a 作為與腹膜纖維化顯著相關(guān)的miRNA，其與腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)之間的關(guān)系尚未見報道。

外泌體是一類直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)等成分，電子顯微鏡下觀察呈杯狀。外泌體可由多種細(xì)胞分泌，也存在于多種體液中，如血液或尿液。腹膜透析濾出液（peritoneal dialysis effluent，PDE）是PD 患者獨特的臨床樣本，取材簡便，標(biāo)本易得。許多研究發(fā)現(xiàn)PDE 中的白介素-6 （interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 單 核 細(xì) 胞 趨 化 蛋 白1 （monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallop roteindse 2，MMP2）等細(xì)胞因子［9-11］，胰脂肪酶［12］及一些miRNA 可能與腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)相關(guān)。另有研究［13-14］發(fā)現(xiàn)直接從PDE 或PDE 離心后所得沉淀中提取到的細(xì)胞內(nèi)miRNA 也與腹膜轉(zhuǎn)運特性相關(guān)。本研究不同于既往研究，所提取的PDE 外泌體miRNA 主要為細(xì)胞外miRNA，外泌體雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的包裹使其較游離miRNA更穩(wěn)定，且可發(fā)揮信息傳遞的作用。

本研究通過提取PDE 中的外泌體miRNA，比較外泌體miR-200a 在不同腹膜轉(zhuǎn)運特性患者中的表達(dá)差異，探索其是否與腹膜轉(zhuǎn)運特性相關(guān)，是否能成為監(jiān)測腹膜狀態(tài)改變的一種新型分子標(biāo)志物，并利用生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-200a及其靶基因影響腹膜轉(zhuǎn)運特性的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本收集

選取于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院行維持性PD 的患者，透析方案均為持續(xù)性不臥床腹膜透析，夜間留腹6～10 h，日間留腹方案可不同?；颊吣挲g18～80 歲，連續(xù)3 次PET 值提示其轉(zhuǎn)運特性為穩(wěn)定的高轉(zhuǎn)運/高平均轉(zhuǎn)運或低轉(zhuǎn)運/低平均轉(zhuǎn)運；據(jù)此將患者分為H 組（高轉(zhuǎn)運/高平均轉(zhuǎn)運）和L 組（低轉(zhuǎn)運/低平均轉(zhuǎn)運）。近3 個月內(nèi)發(fā)生過腹膜炎或其他部位感染者、惡性腫瘤患者、有肝炎或結(jié)核病史的患者及自身免疫疾病患者均不予納入研究。最后，納入H 組和L 組各10 例患者，收集這些患者的基本臨床資料。本研究于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院科研倫理審查委員會備案（審批號SH9H-2020-T23-1）。

1.2 外泌體的提取

收集PD 患者行PET 前1 d 留腹過夜的PDE 500 mL，經(jīng)截留相對分子質(zhì)量為10 000 的再生纖維素膜在超濾杯（Millipore，美國） 中濃縮至40 mL；于2 500×g 離心15 min 去除濃縮液中的細(xì)胞碎片后，18 000×g 高速離心30 min；0.22 μm 孔徑濾器過濾，去除上清液中的大分子物質(zhì)；在超速離心機(jī)中（Beckman，美國）120 000×g 離心2 h，加入PBS再次120 000×g離心清洗2 h后棄去上清液；用200 μL PBS 重懸，得到外泌體。所有離心過程均于4 ℃下進(jìn)行。外泌體提取后立即提取miRNA 或保存于-80 ℃。

1.3 外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（FEI，美國）用于觀察外泌體的形態(tài)和大小。納米粒子跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）系統(tǒng)（PMX，德國）用于分析外泌體的粒徑和濃度。Western blotting檢測外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9和CD63。

1.4 Western blotting檢測蛋白CD9和CD63

10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；5%牛奶封閉2 h 后，抗CD9和抗CD63（1∶1 000，SBI，美國）抗體4 ℃孵育過夜；二抗（1∶5 000，proteintech，美國）室溫孵育1 h；滴加ECL顯影液后在化學(xué)發(fā)光顯影儀下顯影。

1.5 外泌體miRNA提取

用miRNeasy（Qiagen，德國）提取外泌體miRNA；在外泌體中加入5 倍體積的TRIzol、3.5 μL 外參cel-miR-39，以及與外泌體等體積氯仿；4 ℃下12 000×g 離心15 min，取上清液加入1.5倍體積100%乙醇；所得混合液經(jīng)過RNeasy spin column 12 000×g 反復(fù)離心洗滌；用去RNA酶水洗脫膜上的RNA，將所得RNA進(jìn)行定量。

1.6 實時熒光定量PCR檢測外泌體miR-200a的表達(dá)

采用miDETECT A TrackTMmiRNA 試劑盒（廣州銳博，中國）將外泌體miRNA 經(jīng)過加polyA 尾反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃2 s，退火60 ℃20 s，延伸70 ℃10 s，重復(fù)40 個循環(huán)。以miR-39為外參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.7 靶基因預(yù)測及功能富集

使用在線數(shù)據(jù)庫Targetscan、miRmap 和miRWalk 進(jìn)行miRNA 的靶基因預(yù)測分析。采用String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）預(yù)測相關(guān)蛋白，采用Cytoscape 軟件將蛋白間相互作用關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）進(jìn)行可視化，采用MCODE 插件將其進(jìn)行模塊化。采用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行靶基因功能富集（gene ontology，GO）分析，RStudio 軟件作圖。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用x±s 表示，組間比較采用t 檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。定性資料組間比較采用Fisher 確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDE外泌體的鑒定

通過超速離心法得到的濃縮后PDE 中的外泌體，在TEM 下呈圓形雙層膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)（圖1A）；NTA 檢測多數(shù)囊泡直徑介于50～150 nm （圖1B）；Western blotting 結(jié)果顯示其具有外泌體表面標(biāo)志物CD9 和CD63（圖1C）。

圖1 PDE外泌體的鑒定Fig 1 Identification of PDE exosomes

2.2 miR-200a在2組PDE外泌體中的表達(dá)差異

20 例患者的基本信息見表1。H 組和L 組患者男女比例、年齡、透析齡、估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、尿素清除指數(shù)（Kt/V）比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。2 組PET 值比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。以miR-39為外參，RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖2）：L 組PDE 外泌體miR-200a 的表達(dá)水平高于H組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。

2.3 miR-200a與PET值、4 h超濾量和24 h超濾量的相關(guān)性

將PET 結(jié)束時的超濾量作為4 h 超濾量，患者行PET前24 h 內(nèi)的總超濾量作為24 h 超濾量。對H 組和L 組miR-200a 的相對表達(dá)量分別與PET 值、4 h 和24 h 超濾量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖3）顯示：PDE 外泌體miR-200a/miR-39 與PET 值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.871，P=0.000），與4 h 超濾量呈正相關(guān)（r=0.448，P=0.048），但其與24 h超濾量無相關(guān)性（r=0.355，P=0.125）。

表1 PD患者的臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of PD patients

圖2 2組PDE外泌體miR-200a表達(dá)水平的比較Fig 2 Comparison of expression of PDE exosomal miR-200a between the two groups

2.4 miR-200a靶基因預(yù)測及分析

通過Targetscan、miRmap 和miRWalk 3 種miRNA 靶基因在線預(yù)測數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測到的miR-200a 靶基因有679 種（圖4A）。選取參與EMT 相關(guān)的GO 功能——GO 0002053 正向調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞增殖的靶基因，發(fā)現(xiàn)有6 種基因富集在此生物過程中，分別為矮小同源盒基因（short stature homeobox 2， SHOX2）、 WNT 家 族5A（WNT family member 5A，WNT5A）、成纖維細(xì)胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1， FGFR1）、轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體（transforming growth factor β receptor 2，TGFBR2）、腫瘤蛋白p63（tumor protein p63，TP63）、叉頭框蛋白P1（forkhead box P1，F(xiàn)OXP1）；再利用String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建EMT 相關(guān)靶基因表達(dá)的蛋白與其他蛋白之間的PPI；最后使用Cytoscape軟件的MCODE功能進(jìn)行模塊分析。結(jié)果顯示，2 個靶基因聚集在模塊中，參與纖維化過程的發(fā)生和進(jìn)展（圖4B）。

圖3 PDE外泌體miR-200a與PET值、4 h和24 h超濾量的相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis between PDE exosomal miR-200a and PET values,4 h and 24 h ultrafiltration volume

圖4 miR-200a潛在靶基因預(yù)測及EMT相關(guān)靶基因表達(dá)蛋白的PPI模塊Fig 4 Prediction of target genes of miR-200a and PPI modules of EMT-related target genes expressing proteins

2.5 miR-200a靶基因功能分析

為進(jìn)一步研究miR-200a 在PD 中的作用，將679 個靶基因輸入到DAVID 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO 分析（P＜0.05），包括 分 子 功 能（molecular function， MF）、 細(xì) 胞 組 分（cellular component， CC）、 生 物 學(xué) 過 程（biological process，BP）3 個部分（圖5）。結(jié)果顯示：miR-200a 的靶基因參與了許多重要的細(xì)胞組分；其參與的生物學(xué)過程不僅包括正向調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞增殖，同時也能正向調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并參與調(diào)控凋亡過程和蛋白磷酸化；分子功能方面顯示其可能影響ATP、DNA 和mRNA 等的結(jié)合過程，在金屬離子結(jié)合方面也有一定的富集。值得注意的是，溶質(zhì)載體（solute carrier，SLC）家族中有多種蛋白的編碼基因均為miR-200a 的靶基因。SLC 家族為典型的跨膜蛋白，負(fù)責(zé)氨基酸、核苷酸、葡萄糖、無機(jī)離子和藥物等物質(zhì)的吸收和運輸［15-17］，如SLC9A5［也稱為鈉氫轉(zhuǎn)運體5（NHE5）］、SLC10A1 為鈉/膽汁酸協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白，SLC17A4 為鈉/磷酸鹽共轉(zhuǎn)運蛋白。此外，編碼鈉離子電壓門控通道（sodium voltage-gate channel，SCN）亞基蛋白也可能為miR-200a 的靶點。由此推測，miR-200a 除影響EMT 或細(xì)胞凋亡等過程外，還可能通過調(diào)控離子結(jié)合、離子轉(zhuǎn)運，影響各種離子、小分子等溶質(zhì)轉(zhuǎn)運，從而參與腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)的發(fā)生過程。

圖5 miR-200a靶基因的GO富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of miR-200a target genes

3 討論

PD 是終末期腎臟?。╡nd-stage renal disease，ESRD）患者的主要腎臟替代治療方法之一，具有血流動力學(xué)穩(wěn)定、中分子清除效率好、居家治療安全方便等優(yōu)點。PD患者的中期（至少5年）生存率基本等同于血液透析患者的生存率［18］。雖然PD 技術(shù)在不斷發(fā)展和改進(jìn)，但是腹膜形態(tài)和功能的改變?nèi)詴?dǎo)致患者出現(xiàn)一些并發(fā)癥，影響患者的透析質(zhì)量。腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)與腹膜纖維化、超濾衰竭和技術(shù)失敗密切相關(guān)［5］，因此及時有效地獲得腹膜轉(zhuǎn)運特性的信息對早期預(yù)防和診斷相關(guān)并發(fā)癥具有重要意義。

外泌體是由細(xì)胞分泌的特異性囊泡，參與細(xì)胞間通信，發(fā)揮多種功能［19］。利用來自血液或尿液的外泌體miRNA 作為診斷疾病的生物標(biāo)志，也是“液體活檢”的一種新興方法，但很少有研究報道PDE 中的外泌體及其組成。2017 年，Carreras-Planella 等［20］首次報道了PDE中細(xì)胞外囊泡的存在并予以分離；隨后相關(guān)研究［21］通過多種方法，如差速離心、排阻色譜法以及納米顆粒跟蹤分析等證實這些囊泡大多數(shù)為外泌體。本研究將濃縮后的PDE 進(jìn)行超速離心，并利用TEM、NTA 和Western blotting等方法鑒定，成功提取到了PDE來源的外泌體。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a 可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/Notch1 信號 通 路［22］以 及miR-200a/Smad7/TGF- β1/EMT/MAPK軸［23］參與抗肝臟纖維化的過程，也可通過抑制ZEB1/2改善腹膜纖維化［7-8］，但未發(fā)現(xiàn)miR-200a與腹膜高轉(zhuǎn)運狀態(tài)相關(guān)。本實驗將20 例PD 患者按照PET 值分為H 組和L 組，提取PDE 外泌體miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體miR-200a 在L 組的相對表達(dá)量較高，并且其表達(dá)量與PET 值呈一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與4 h 超濾量呈正相關(guān)關(guān)系，但與24 h超濾量并無相關(guān)性。

Targetscan 是最常用的miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫之一，提供多物種信息，通過與miRNA 種子區(qū)域匹配的保守的8mer 和7mer 位點來預(yù)測靶基因。miRWalk 記錄了基因全長序列上的miRNA 結(jié)合位點，也將其與已有的12個miRNA靶標(biāo)預(yù)測程序的預(yù)測信息進(jìn)行結(jié)合關(guān)聯(lián)。miRmap將涵蓋11 種預(yù)測特征的4 種方法集合在一個模型中，預(yù)測能力較強(qiáng)。為避免預(yù)測假陽性，本研究同時使用3個數(shù)據(jù)庫，對其共同預(yù)測到的基因交集進(jìn)行分析。在對預(yù)測到的miR-200a 靶基因進(jìn)行GO 分析后，本研究選取EMT相關(guān)的GO 功能組，對6 個靶基因表達(dá)蛋白進(jìn)行PPI 模塊分析，發(fā)現(xiàn)FGFR1 和TGFBR2 主要聚集在2 個模塊，通過參與相關(guān)信號通路促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)纖維化。此外，對miR-200a 的GO 分析結(jié)果也顯示，其靶基因在組成細(xì)胞成分、調(diào)控凋亡過程以及參與ATP、DNA、mRNA和金屬離子結(jié)合方面有一定富集。

本研究成功提取并鑒定了PDE 來源外泌體，探究了PDE 外泌體miR-200a 與轉(zhuǎn)運特性的關(guān)系，也對miR-200a進(jìn)行了靶基因預(yù)測和GO富集分析；發(fā)現(xiàn)其靶基因中有許多SLC 家族蛋白，可能在離子結(jié)合、離子和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運等方面具有一定的調(diào)控功能。本研究為探討miRNA 如何影響腹膜轉(zhuǎn)運特性的機(jī)制問題提供了新思路。但本研究只選取了20 例PD 患者，樣本量較少，具有一定的局限性。首先，本研究未觀察到miR-200a 的相對表達(dá)量與24 h 超濾量的相關(guān)性；分析原因可能為影響24 h 超濾量的因素較多，如PD 方案、患者殘腎功能和24 h 尿量。若要證明PDE 外泌體miR-200a 可成為判斷腹膜轉(zhuǎn)運特性的標(biāo)志物及其與24 h 超濾量的關(guān)系，需要多中心、大樣本的研究進(jìn)行驗證。其次，本研究沒有確定PDE 外泌體的來源。腹膜組織主要由間皮細(xì)胞組成，腹膜腔內(nèi)也有一些免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等［24］；因此，PDE 外泌體可能由多種細(xì)胞分泌，可進(jìn)一步檢測外泌體表面蛋白，鑒別其具體來源。再次，我們只選取了miR-200a 作為目標(biāo)miRNA，還有一些參與多種功能調(diào)控的miRNA，如miR-21，值得在后續(xù)實驗中進(jìn)一步討論。最后，我們通過生物信息學(xué)分析，認(rèn)為miR-200a 可能通過調(diào)控SLC 家族影響離子結(jié)合或離子轉(zhuǎn)運，但未進(jìn)行實驗驗證，相關(guān)分子機(jī)制和信號通路仍需深入研究。

綜上所述，本研究通過提取PDE 外泌體，比較外泌體miR-200a 在不同腹膜轉(zhuǎn)運特性患者PDE 中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運特性較低的患者PDE 外泌體miR-200a 的相對表達(dá)量較高，并且miR-200a的相對表達(dá)量與PET值呈負(fù)相關(guān)，與4 h 超濾量呈正相關(guān)；但其與24 h 超濾量是否相關(guān)，是否影響離子結(jié)合及相關(guān)作用機(jī)制需要更多實驗進(jìn)一步探討。