佟 琰,方均燕,鄧 海,宋阿會(huì),李 璞,劉英莉
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腎內(nèi)科,上海200011
腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)利用人體自身的腹膜作為透析膜,清除體內(nèi)的毒素和過多的水分[1]。溶質(zhì)通過腹膜的速度,即腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率(peritoneal solute transport rate,PSTR),是評(píng)價(jià)腹膜性能的重要指標(biāo)。臨床上常通過腹膜平衡試驗(yàn)(peritoneal equilibrium test,PET)對(duì)PSTR 進(jìn)行評(píng)估,按照4 h 腹膜透析濾出液/血漿肌酐濃度比值(4h D/PCr)數(shù)值分為高轉(zhuǎn)運(yùn)(0.82~1.03)、高平均轉(zhuǎn)運(yùn)(0.65~0.81)、低平均轉(zhuǎn)運(yùn)(0.50~0.64)和低轉(zhuǎn)運(yùn)(0.34~0.49)[2-3]。腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)的患者容量清除較差,更容易出現(xiàn)水鈉潴留、超濾衰竭和腹膜纖維化等PD 相關(guān)并發(fā)癥[4-5]。上皮細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是腹膜纖維化形成的重要病理生理過程[6]。在一項(xiàng)PD 大鼠動(dòng)物模型的研究[7-8]中發(fā)現(xiàn),腹膜纖維化早期miR-200a 的表達(dá)減少,并且miR-200a 可以通過靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白1/2 (zinc finger E-box-binding homeobox 1/2,ZEB1/2)負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)誘導(dǎo)的EMT。腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)與腹膜纖維化直接相關(guān),而miR-200a 作為與腹膜纖維化顯著相關(guān)的miRNA,其與腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。
外泌體是一類直徑為30~150 nm的細(xì)胞外囊泡,內(nèi)含蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)等成分,電子顯微鏡下觀察呈杯狀。外泌體可由多種細(xì)胞分泌,也存在于多種體液中,如血液或尿液。腹膜透析濾出液(peritoneal dialysis effluent,PDE)是PD 患者獨(dú)特的臨床樣本,取材簡(jiǎn)便,標(biāo)本易得。許多研究發(fā)現(xiàn)PDE 中的白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、 單 核 細(xì) 胞 趨 化 蛋 白1 (monocyte chemoattractant protein 1,MCP1)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallop roteindse 2,MMP2)等細(xì)胞因子[9-11],胰脂肪酶[12]及一些miRNA 可能與腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)相關(guān)。另有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)直接從PDE 或PDE 離心后所得沉淀中提取到的細(xì)胞內(nèi)miRNA 也與腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性相關(guān)。本研究不同于既往研究,所提取的PDE 外泌體miRNA 主要為細(xì)胞外miRNA,外泌體雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的包裹使其較游離miRNA更穩(wěn)定,且可發(fā)揮信息傳遞的作用。
本研究通過提取PDE 中的外泌體miRNA,比較外泌體miR-200a 在不同腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性患者中的表達(dá)差異,探索其是否與腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性相關(guān),是否能成為監(jiān)測(cè)腹膜狀態(tài)改變的一種新型分子標(biāo)志物,并利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-200a及其靶基因影響腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的相關(guān)機(jī)制。
選取于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院行維持性PD 的患者,透析方案均為持續(xù)性不臥床腹膜透析,夜間留腹6~10 h,日間留腹方案可不同?;颊吣挲g18~80 歲,連續(xù)3 次PET 值提示其轉(zhuǎn)運(yùn)特性為穩(wěn)定的高轉(zhuǎn)運(yùn)/高平均轉(zhuǎn)運(yùn)或低轉(zhuǎn)運(yùn)/低平均轉(zhuǎn)運(yùn);據(jù)此將患者分為H 組(高轉(zhuǎn)運(yùn)/高平均轉(zhuǎn)運(yùn))和L 組(低轉(zhuǎn)運(yùn)/低平均轉(zhuǎn)運(yùn))。近3 個(gè)月內(nèi)發(fā)生過腹膜炎或其他部位感染者、惡性腫瘤患者、有肝炎或結(jié)核病史的患者及自身免疫疾病患者均不予納入研究。最后,納入H 組和L 組各10 例患者,收集這些患者的基本臨床資料。本研究于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院科研倫理審查委員會(huì)備案(審批號(hào)SH9H-2020-T23-1)。
收集PD 患者行PET 前1 d 留腹過夜的PDE 500 mL,經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000 的再生纖維素膜在超濾杯(Millipore,美國(guó)) 中濃縮至40 mL;于2 500×g 離心15 min 去除濃縮液中的細(xì)胞碎片后,18 000×g 高速離心30 min;0.22 μm 孔徑濾器過濾,去除上清液中的大分子物質(zhì);在超速離心機(jī)中(Beckman,美國(guó))120 000×g 離心2 h,加入PBS再次120 000×g離心清洗2 h后棄去上清液;用200 μL PBS 重懸,得到外泌體。所有離心過程均于4 ℃下進(jìn)行。外泌體提取后立即提取miRNA 或保存于-80 ℃。
透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)(FEI,美國(guó))用于觀察外泌體的形態(tài)和大小。納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)系統(tǒng)(PMX,德國(guó))用于分析外泌體的粒徑和濃度。Western blotting檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9和CD63。
10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上;5%牛奶封閉2 h 后,抗CD9和抗CD63(1∶1 000,SBI,美國(guó))抗體4 ℃孵育過夜;二抗(1∶5 000,proteintech,美國(guó))室溫孵育1 h;滴加ECL顯影液后在化學(xué)發(fā)光顯影儀下顯影。
用miRNeasy(Qiagen,德國(guó))提取外泌體miRNA;在外泌體中加入5 倍體積的TRIzol、3.5 μL 外參cel-miR-39,以及與外泌體等體積氯仿;4 ℃下12 000×g 離心15 min,取上清液加入1.5倍體積100%乙醇;所得混合液經(jīng)過RNeasy spin column 12 000×g 反復(fù)離心洗滌;用去RNA酶水洗脫膜上的RNA,將所得RNA進(jìn)行定量。
采用miDETECT A TrackTMmiRNA 試劑盒(廣州銳博,中國(guó))將外泌體miRNA 經(jīng)過加polyA 尾反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃10 min;變性95 ℃2 s,退火60 ℃20 s,延伸70 ℃10 s,重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。以miR-39為外參,采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan、miRmap 和miRWalk 進(jìn)行miRNA 的靶基因預(yù)測(cè)分析。采用String 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白,采用Cytoscape 軟件將蛋白間相互作用關(guān)系(protein-protein interaction,PPI)進(jìn)行可視化,采用MCODE 插件將其進(jìn)行模塊化。采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行靶基因功能富集(gene ontology,GO)分析,RStudio 軟件作圖。
采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用x±s 表示,組間比較采用t 檢驗(yàn);非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用M(P25,P75)表示,組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。定性資料組間比較采用Fisher 確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
通過超速離心法得到的濃縮后PDE 中的外泌體,在TEM 下呈圓形雙層膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)(圖1A);NTA 檢測(cè)多數(shù)囊泡直徑介于50~150 nm (圖1B);Western blotting 結(jié)果顯示其具有外泌體表面標(biāo)志物CD9 和CD63(圖1C)。
圖1 PDE外泌體的鑒定Fig 1 Identification of PDE exosomes
20 例患者的基本信息見表1。H 組和L 組患者男女比例、年齡、透析齡、估算腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、尿素清除指數(shù)(Kt/V)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。2 組PET 值比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。以miR-39為外參,RT-qPCR 結(jié)果顯示(圖2):L 組PDE 外泌體miR-200a 的表達(dá)水平高于H組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
將PET 結(jié)束時(shí)的超濾量作為4 h 超濾量,患者行PET前24 h 內(nèi)的總超濾量作為24 h 超濾量。對(duì)H 組和L 組miR-200a 的相對(duì)表達(dá)量分別與PET 值、4 h 和24 h 超濾量進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果(圖3)顯示:PDE 外泌體miR-200a/miR-39 與PET 值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.871,P=0.000),與4 h 超濾量呈正相關(guān)(r=0.448,P=0.048),但其與24 h超濾量無相關(guān)性(r=0.355,P=0.125)。
表1 PD患者的臨床資料Tab 1 Clinical characteristics of PD patients
圖2 2組PDE外泌體miR-200a表達(dá)水平的比較Fig 2 Comparison of expression of PDE exosomal miR-200a between the two groups
通過Targetscan、miRmap 和miRWalk 3 種miRNA 靶基因在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同預(yù)測(cè)到的miR-200a 靶基因有679 種(圖4A)。選取參與EMT 相關(guān)的GO 功能——GO 0002053 正向調(diào)節(jié)間充質(zhì)細(xì)胞增殖的靶基因,發(fā)現(xiàn)有6 種基因富集在此生物過程中,分別為矮小同源盒基因(short stature homeobox 2, SHOX2)、 WNT 家 族5A(WNT family member 5A,WNT5A)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1, FGFR1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型受體(transforming growth factor β receptor 2,TGFBR2)、腫瘤蛋白p63(tumor protein p63,TP63)、叉頭框蛋白P1(forkhead box P1,F(xiàn)OXP1);再利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建EMT 相關(guān)靶基因表達(dá)的蛋白與其他蛋白之間的PPI;最后使用Cytoscape軟件的MCODE功能進(jìn)行模塊分析。結(jié)果顯示,2 個(gè)靶基因聚集在模塊中,參與纖維化過程的發(fā)生和進(jìn)展(圖4B)。
圖3 PDE外泌體miR-200a與PET值、4 h和24 h超濾量的相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis between PDE exosomal miR-200a and PET values,4 h and 24 h ultrafiltration volume
圖4 miR-200a潛在靶基因預(yù)測(cè)及EMT相關(guān)靶基因表達(dá)蛋白的PPI模塊Fig 4 Prediction of target genes of miR-200a and PPI modules of EMT-related target genes expressing proteins
為進(jìn)一步研究miR-200a 在PD 中的作用,將679 個(gè)靶基因輸入到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO 分析(P<0.05),包括 分 子 功 能(molecular function, MF)、 細(xì) 胞 組 分(cellular component, CC)、 生 物 學(xué) 過 程(biological process,BP)3 個(gè)部分(圖5)。結(jié)果顯示:miR-200a 的靶基因參與了許多重要的細(xì)胞組分;其參與的生物學(xué)過程不僅包括正向調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞增殖,同時(shí)也能正向調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移,并參與調(diào)控凋亡過程和蛋白磷酸化;分子功能方面顯示其可能影響ATP、DNA 和mRNA 等的結(jié)合過程,在金屬離子結(jié)合方面也有一定的富集。值得注意的是,溶質(zhì)載體(solute carrier,SLC)家族中有多種蛋白的編碼基因均為miR-200a 的靶基因。SLC 家族為典型的跨膜蛋白,負(fù)責(zé)氨基酸、核苷酸、葡萄糖、無機(jī)離子和藥物等物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸[15-17],如SLC9A5[也稱為鈉氫轉(zhuǎn)運(yùn)體5(NHE5)]、SLC10A1 為鈉/膽汁酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,SLC17A4 為鈉/磷酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。此外,編碼鈉離子電壓門控通道(sodium voltage-gate channel,SCN)亞基蛋白也可能為miR-200a 的靶點(diǎn)。由此推測(cè),miR-200a 除影響EMT 或細(xì)胞凋亡等過程外,還可能通過調(diào)控離子結(jié)合、離子轉(zhuǎn)運(yùn),影響各種離子、小分子等溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),從而參與腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)的發(fā)生過程。
圖5 miR-200a靶基因的GO富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of miR-200a target genes
PD 是終末期腎臟?。╡nd-stage renal disease,ESRD)患者的主要腎臟替代治療方法之一,具有血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定、中分子清除效率好、居家治療安全方便等優(yōu)點(diǎn)。PD患者的中期(至少5年)生存率基本等同于血液透析患者的生存率[18]。雖然PD 技術(shù)在不斷發(fā)展和改進(jìn),但是腹膜形態(tài)和功能的改變?nèi)詴?huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)一些并發(fā)癥,影響患者的透析質(zhì)量。腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)與腹膜纖維化、超濾衰竭和技術(shù)失敗密切相關(guān)[5],因此及時(shí)有效地獲得腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的信息對(duì)早期預(yù)防和診斷相關(guān)并發(fā)癥具有重要意義。
外泌體是由細(xì)胞分泌的特異性囊泡,參與細(xì)胞間通信,發(fā)揮多種功能[19]。利用來自血液或尿液的外泌體miRNA 作為診斷疾病的生物標(biāo)志,也是“液體活檢”的一種新興方法,但很少有研究報(bào)道PDE 中的外泌體及其組成。2017 年,Carreras-Planella 等[20]首次報(bào)道了PDE中細(xì)胞外囊泡的存在并予以分離;隨后相關(guān)研究[21]通過多種方法,如差速離心、排阻色譜法以及納米顆粒跟蹤分析等證實(shí)這些囊泡大多數(shù)為外泌體。本研究將濃縮后的PDE 進(jìn)行超速離心,并利用TEM、NTA 和Western blotting等方法鑒定,成功提取到了PDE來源的外泌體。
研究發(fā)現(xiàn),miR-200a 可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/Notch1 信號(hào) 通 路[22]以 及miR-200a/Smad7/TGF- β1/EMT/MAPK軸[23]參與抗肝臟纖維化的過程,也可通過抑制ZEB1/2改善腹膜纖維化[7-8],但未發(fā)現(xiàn)miR-200a與腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將20 例PD 患者按照PET 值分為H 組和L 組,提取PDE 外泌體miRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體miR-200a 在L 組的相對(duì)表達(dá)量較高,并且其表達(dá)量與PET 值呈一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系,與4 h 超濾量呈正相關(guān)關(guān)系,但與24 h超濾量并無相關(guān)性。
Targetscan 是最常用的miRNA 靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)之一,提供多物種信息,通過與miRNA 種子區(qū)域匹配的保守的8mer 和7mer 位點(diǎn)來預(yù)測(cè)靶基因。miRWalk 記錄了基因全長(zhǎng)序列上的miRNA 結(jié)合位點(diǎn),也將其與已有的12個(gè)miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)程序的預(yù)測(cè)信息進(jìn)行結(jié)合關(guān)聯(lián)。miRmap將涵蓋11 種預(yù)測(cè)特征的4 種方法集合在一個(gè)模型中,預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。為避免預(yù)測(cè)假陽(yáng)性,本研究同時(shí)使用3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)其共同預(yù)測(cè)到的基因交集進(jìn)行分析。在對(duì)預(yù)測(cè)到的miR-200a 靶基因進(jìn)行GO 分析后,本研究選取EMT相關(guān)的GO 功能組,對(duì)6 個(gè)靶基因表達(dá)蛋白進(jìn)行PPI 模塊分析,發(fā)現(xiàn)FGFR1 和TGFBR2 主要聚集在2 個(gè)模塊,通過參與相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)纖維化。此外,對(duì)miR-200a 的GO 分析結(jié)果也顯示,其靶基因在組成細(xì)胞成分、調(diào)控凋亡過程以及參與ATP、DNA、mRNA和金屬離子結(jié)合方面有一定富集。
本研究成功提取并鑒定了PDE 來源外泌體,探究了PDE 外泌體miR-200a 與轉(zhuǎn)運(yùn)特性的關(guān)系,也對(duì)miR-200a進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)和GO富集分析;發(fā)現(xiàn)其靶基因中有許多SLC 家族蛋白,可能在離子結(jié)合、離子和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面具有一定的調(diào)控功能。本研究為探討miRNA 如何影響腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的機(jī)制問題提供了新思路。但本研究只選取了20 例PD 患者,樣本量較少,具有一定的局限性。首先,本研究未觀察到miR-200a 的相對(duì)表達(dá)量與24 h 超濾量的相關(guān)性;分析原因可能為影響24 h 超濾量的因素較多,如PD 方案、患者殘腎功能和24 h 尿量。若要證明PDE 外泌體miR-200a 可成為判斷腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的標(biāo)志物及其與24 h 超濾量的關(guān)系,需要多中心、大樣本的研究進(jìn)行驗(yàn)證。其次,本研究沒有確定PDE 外泌體的來源。腹膜組織主要由間皮細(xì)胞組成,腹膜腔內(nèi)也有一些免疫細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等[24];因此,PDE 外泌體可能由多種細(xì)胞分泌,可進(jìn)一步檢測(cè)外泌體表面蛋白,鑒別其具體來源。再次,我們只選取了miR-200a 作為目標(biāo)miRNA,還有一些參與多種功能調(diào)控的miRNA,如miR-21,值得在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步討論。最后,我們通過生物信息學(xué)分析,認(rèn)為miR-200a 可能通過調(diào)控SLC 家族影響離子結(jié)合或離子轉(zhuǎn)運(yùn),但未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,相關(guān)分子機(jī)制和信號(hào)通路仍需深入研究。
綜上所述,本研究通過提取PDE 外泌體,比較外泌體miR-200a 在不同腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性患者PDE 中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)特性較低的患者PDE 外泌體miR-200a 的相對(duì)表達(dá)量較高,并且miR-200a的相對(duì)表達(dá)量與PET值呈負(fù)相關(guān),與4 h 超濾量呈正相關(guān);但其與24 h 超濾量是否相關(guān),是否影響離子結(jié)合及相關(guān)作用機(jī)制需要更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。