袁亞杰， 丁豪杰， 孔慶明

杭州醫(yī)學(xué)院 寄生蟲病研究所， 杭州 310000

肝病在全球尤其是亞太地區(qū)是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。全球每年有100多萬人死于HBV、HCV感染引起的肝硬化和肝癌，預(yù)計2040年全球慢性肝炎死亡人數(shù)約達(dá)220萬，將超過HIV感染、結(jié)核病和瘧疾相關(guān)的總死亡人數(shù)(約190萬)[1]。近年來，隨著肥胖和2型糖尿病在全球的流行，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發(fā)病率相應(yīng)增加。據(jù)估計，從2016年—2030年，NAFLD發(fā)展為晚期肝病的人數(shù)以及導(dǎo)致的死亡率將會增加1倍以上[3]。肝纖維化是乙型肝炎、NAFLD、肝癌等各種慢性肝病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，也是肝病治療的關(guān)鍵階段[4]。肝纖維化的有效干預(yù)能夠提高肝病患者的生存率，對于肝病防治具有重大意義。

microRNA(miRNA)是一類生物體內(nèi)廣泛存在的長21～26 nt的非編碼微小核糖核酸，通過與靶mRNA 3′UTR結(jié)合抑制其翻譯而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。研究[5]發(fā)現(xiàn)miRNA在肝病的發(fā)生、發(fā)展與干預(yù)中具有重要調(diào)控作用。miRNA-335位于染色體7q32.2，由MEST的內(nèi)含子編碼(圖1)，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及衰老過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究[6-9]顯示，miRNA-335在HBV感染、華支睪吸蟲感染的肝組織，肝纖維化組織，以及肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平均下調(diào)，并通過靶向Rho蛋白激酶1(Rho associated protein kinase 1, ROCK1)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase, MAPK1)等基因參與調(diào)控肝病的發(fā)生發(fā)展。本文將綜述miRNA-335在肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)調(diào)控功能，以期為肝病的診治提供新思路。

圖1 miRNA-335及其宿主基因MEST[5]

1 miRNA-335與肝臟炎癥

miRNA-335參與調(diào)控肝臟炎癥。作為決定細(xì)胞命運和組織形態(tài)形成的上游調(diào)控因子，Y盒上的性別決定區(qū)(sex-determining region on Y box, SOX)轉(zhuǎn)錄因子已被選為肝臟疾病的干預(yù)靶點[10]。HBV感染能夠激活SOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員SOX4的轉(zhuǎn)錄，激活的SOX4又可以促進(jìn)HBV復(fù)制。在HBV感染的肝臟中，miRNA-335靶向抑制SOX4的表達(dá)。因此，HBV感染過程中可能存在HBV/miRNA-335/SOX4正反饋回路[6]。在NAFLD中，SOX4直接靶向調(diào)控甾醇調(diào)節(jié)因子原件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1c(sterol regulator element binding transcription factor 1c, SREBP-1c)基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控甘油三脂(TG)的水平[11]。研究[12]顯示，miRNA-335在肥胖小鼠ob/ob肝臟與脂肪組織中表達(dá)上調(diào)，參與脂肪代謝。SREBP-1c屬于SREBP1s轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生，也可以阻斷脂多糖(LPS)激活的TLR4信號通路，在肝臟脂肪炎癥的調(diào)控中具有雙重作用[13]。

NF-κB信號通路是肝損傷、肝纖維化與肝細(xì)胞癌的調(diào)控樞紐，可被LPS誘導(dǎo)的TLR4激活，在肝病進(jìn)展中具有重要作用。NF-κB可被上游的雙特異性磷酸酶14(dual specificity phosphatase, DUSP14)抑制，DUSP14直接與TGFβ激酶1(TGFβ acvivated kinase 1, TAK1)結(jié)合并使其去磷酸化，降低TAK1活性以及下游信號分子JNK、p38和NF-κB的活性[14]。在肝臟炎癥中，NF-κB受腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TNF receptor associated factor 3, TRAF3)的正向調(diào)控作用[15]。肝細(xì)胞中的TRAF3結(jié)合TAK1誘導(dǎo)其泛素化和自磷酸化，從而增強(qiáng)下游IKKβ/NF-κB和MKK/JNK/IRS1級聯(lián)反應(yīng)[16]。在下肢靜脈血栓中，miRNA-335能夠抑制NF-κB通路[17]。在肝臟疾病中，miRNA-335能否調(diào)控NF-κB信號通路有待進(jìn)一步研究 (圖2)。

注：，上調(diào)或促進(jìn)作用；，下調(diào)或抑制作用；，尚未在肝病中證實；棕色代表已在肝病中證實。

2 miRNA-335與肝纖維化

肝纖維化是肝臟對病毒感染、酒精濫用、代謝性疾病等各種病因引起慢性損傷的一種反應(yīng), 以肝星狀細(xì)胞(HSC)活化遷移和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積為特征，伴隨多種氧化應(yīng)激因子、炎癥促進(jìn)和抑制因子等的產(chǎn)生與調(diào)控。miRNA-335在調(diào)控HSC活化、ECM形成等過程中具有重要作用。

miRNA-335的靶基因缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1-alpha, HIF-1α)[18]、磷酸酶和緊張素同系物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)[19]及ROCK1[9]具有促纖維化作用。缺氧反應(yīng)及經(jīng)典的Hh信號通路活化均可上調(diào)HSC中HIF-1α的表達(dá)[20-21]。在NAFLD向肝纖維化的進(jìn)展過程中，肝細(xì)胞分泌的HIF-1α通過激活PTEN/NF-κB/p65信號通路正向調(diào)控肝纖維化[22]。當(dāng)氧濃度較低時，HSC中HIF-1α的表達(dá)水平隨著時間不斷增加，并上調(diào)ROCK1的表達(dá)，增加膠原的合成和沉積，促進(jìn)纖維化進(jìn)展[20]。ROCK1能夠被上調(diào)的受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)激活，并激活下游TLR4/NF-κB信號通路促進(jìn)肝臟炎癥和肝纖維化[23]。在低氧環(huán)境中，HIF-1α與巰基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1, QSOX1)基因兩個HRE區(qū)結(jié)合誘導(dǎo)QSOX1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9分泌，有利于胰腺癌細(xì)胞的侵襲[24-25]，QSOX1在肝纖維化中的作用尚未明晰。另外，纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)作為miRNA-335的靶基因,是一種與肝纖維化相關(guān)的急性期蛋白，可被肽基-脯氨基異構(gòu)酶活化的TGFβ1誘導(dǎo)，進(jìn)而抑制MMP9活性，加速肝纖維化[17,26-27]。

miRNA-335的靶基因堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族(Twist family bHLH transcription factor 1, Twist1)是一種成纖維細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[28]。Twist1能夠與配對相關(guān)同源框(paired related homebox1, Prrx1)、細(xì)胞黏合素C(tenascin, TNC)相互作用組成正反饋回路Twist1-Prrx-TNC，抑制成纖維細(xì)胞活化[29]。TNC是一種ECM糖蛋白，可促進(jìn)HSC遷移[8]。在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中，巨核細(xì)胞性白血病因子1結(jié)合到Twist1啟動子區(qū)，并以信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活劑3依賴的方式激活Twist1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的EMT過程[30]。而在急性損傷的腎臟中，炎性浸潤巨噬細(xì)胞中的Twist1可促進(jìn)CD11b+Ly6Clo髓樣細(xì)胞中MMP13的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，進(jìn)而抑制腎纖維化進(jìn)展[31](圖3)。

注：，上調(diào)或促進(jìn)作用；/ ，下調(diào)或抑制作用；， 尚未在肝病中證實； 棕色和深藍(lán)色分別代表已在肝病和非肝病中證實。

3 miRNA-335與肝癌

miRNA-335作為一種腫瘤抑制劑能夠靶向抑制間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)，c-Met的異常激活與肝癌發(fā)生有關(guān)，通過肝細(xì)胞分泌的黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)活性誘發(fā)肝癌，是具有肝細(xì)胞生長因子(HGF)/c-Met活性的肝癌潛在治療靶點[32-35]。肝癌發(fā)生時，c-Met可被細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(late SV40 factor, LSF)介導(dǎo)的Opn激活，Opn與其細(xì)胞表面受體CD44結(jié)合上調(diào)c-Met誘發(fā)肝癌[36]。c-Met還能夠通過脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)依賴的方式被絲氨酸/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase, Akt)激活[34]。FASN是脂肪從頭合成的主要調(diào)控因子，在Akt誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生中必不可少[37]。

miRNA-335能夠通過靶向抑制ROCK1進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲[9]。在肝癌細(xì)胞中ROCK1的下調(diào)可抑制NF-κB信號通路，從而抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯肝癌進(jìn)展[38]。在結(jié)直腸癌和骨肉瘤中，miRNA-335的上游調(diào)控分子長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA DANCR)，能夠通過與miRNA-335競爭性結(jié)合，阻斷miRNA-335對ROCK1的抑制作用[39-40]，但是該過程在肝癌中并未見報道。lncRNA DANCR還能夠通過ROCK1/LIMK1/CIFILIN1通路調(diào)節(jié)肝癌生長和EMT形成[41]。作為誘導(dǎo)EMT形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，Twist1在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)。在肝癌中，Twist1可結(jié)合到Cul2啟動子區(qū)激活其轉(zhuǎn)錄活性，并選擇性促進(jìn)Cul2環(huán)狀RNA circ-10720的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)波形蛋白Vimentin表達(dá)，有利于EMT形成[42]。Twist1的上游調(diào)控因子蛋白酶激活受體1 (protease-activated receptor-1, PAR1)能夠通過上調(diào)Twist1促進(jìn)肝癌細(xì)胞通過上皮-內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[43]。Twist1誘導(dǎo)肝癌EMT過程中，還可被信使RNA前體加工因子19(pre-mRNA processing factor 19, Prp19)正向調(diào)控，Prp19直接與TAK1結(jié)合，促進(jìn)p38 /MAPK活化，抑制Twist1降解[44]。另外，miRNA-335還能夠通過靶向抑制E盒結(jié)合鋅指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)/ETS1通路調(diào)控癌細(xì)胞侵襲和遷移[45-46](圖4)。

注：/ ，上調(diào)或促進(jìn)作用；/，下調(diào)或抑制作用；棕色和深藍(lán)色分別代表已在肝病和非肝病中證實。

4 總結(jié)與展望

肝病是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害了人們的身心健康，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，肝纖維化是慢性肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌的必經(jīng)階段，逆轉(zhuǎn)肝纖維化將大大降低肝硬化、肝癌的發(fā)病率。miRNA-335作為一種抑癌分子被廣泛研究，外泌體miRNA-335能夠減小肝腫瘤體積，顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、增殖和遷移，進(jìn)一步研究[47]顯示，miRNA-335能夠靶向調(diào)控ROCK1抑制肝癌。另外，miRNA-335在結(jié)直腸癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和甲狀腺癌細(xì)胞的增殖及遷移中也具有明顯的抑制作用[46,48-49]。目前，已證實的miRNA-335靶基因主要有HIF-1α、ROCK1以及Twist1等，這些基因在纖維化相關(guān)信號通路的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。筆者前期研究(未發(fā)表)表明青蒿琥酯抗血吸蟲性肝纖維化有效且與HSC的增殖活化抑制密切相關(guān)，進(jìn)一步全轉(zhuǎn)錄組分析顯示，miRNA-335及其候選靶基因QSOX1的表達(dá)與青蒿琥酯抗血吸蟲性肝纖維化具有顯著相關(guān)性。據(jù)文獻(xiàn)[24]報道，QSOX1可被HIF-1α上調(diào)，使MMP-2和MMP-9的分泌增加，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲。因此，miRNA-335/QSOX1調(diào)控軸可能通過抑制HSC活化介導(dǎo)青蒿琥酯抗血吸蟲性肝纖維化。進(jìn)一步圍繞miRNA-335在肝纖維化調(diào)控中的深入研究，能夠有望為肝纖維化等肝病的防治提供新思路。

作者貢獻(xiàn)聲明：袁亞杰負(fù)責(zé)資料收集和撰寫論文；丁豪杰參與收集數(shù)據(jù)和論文修改；孔慶明負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。