唐光俊, 游 晶, 劉懷鄂, 彭玉娟

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染性疾病和肝病科， 昆明 650032

HBV感染至今仍呈世界性流行，慢性乙型肝炎(CHB)是當(dāng)今最嚴(yán)重的世界性傳染病之一，極大影響公眾健康及加重衛(wèi)生系統(tǒng)負(fù)擔(dān)。感染HBV后，若患者自身免疫力不足以清除病毒，可發(fā)展為CHB。HBV持續(xù)大量復(fù)制，肝臟長(zhǎng)期處于慢性炎癥狀態(tài)，在免疫系統(tǒng)作用下可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)等嚴(yán)重疾病。 輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)失衡所引起的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡在CHB病情進(jìn)展中扮演著重要角色，了解該失衡機(jī)制及過(guò)程對(duì)于疾病認(rèn)識(shí)、治療及延緩病情進(jìn)展具有重要意義。

1 Th17與Treg

Th17是Harrington等[1]于2005年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種由CD4+T淋巴細(xì)胞分化出的新型輔助性Th亞群，視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體γt(orphan nuclear receptor, RORγt)為標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。在TGFβ的存在下及IL-6、IL-23協(xié)同下，通過(guò)JAK/STAT、NF-ΚB/MAPK等多條信號(hào)途徑由CD4+T淋巴細(xì)胞分化而成[4-5]。

Treg是Sakaguchi等[6]于1995年發(fā)現(xiàn)的一種由CD4+T淋巴細(xì)胞分化出的新型輔助性Th亞群，叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box p3, Foxp3)為標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子[7]。根據(jù)Treg的來(lái)源及穩(wěn)定性的不同，可以將其分為兩類，第一類為天然調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)，存在于胸腺中并形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)，由于獨(dú)特的微環(huán)境獲得抑制能力，在免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；第二類為誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(induced regulatory T cell, iTreg)，在外來(lái)抗原刺激下，經(jīng)TGFβ誘導(dǎo)非Treg轉(zhuǎn)化，穩(wěn)定性較差[8-10]。

CD4+T淋巴細(xì)胞分化為T(mén)h17與Treg的過(guò)程中[11]，IL-6在兩條分化路徑中均起作用，這使得兩種細(xì)胞分化存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系并處于動(dòng)態(tài)平衡中。而且IL-6還可以決定分化途徑的方向，當(dāng)IL-6不存在時(shí)分化向Treg子集；在IL-6存在的情況下則分化向Th17子集。此外由Th17分泌的IL-21與TGFβ一起可激活STAT3途徑增加了RORγt的表達(dá)，加大CD4+T淋巴細(xì)胞分化為T(mén)h17的力度，并抑制Foxp3的表達(dá)，從源頭上減少Treg的分化產(chǎn)生[12]。

Th17在機(jī)體中表現(xiàn)為免疫監(jiān)視，可加強(qiáng)免疫反應(yīng)、促進(jìn)炎癥發(fā)展；是一種高度促炎的細(xì)胞，以分泌IL-17為其最主要特征[13]，IL-17包括IL-17A、IL-17F等亞群，可增強(qiáng)針對(duì)細(xì)胞外細(xì)菌、真菌和病毒的適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答；還可分泌IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TNF等細(xì)胞因子，具有募集、活化中性粒細(xì)胞等作用。Th17還具有效應(yīng)器功能，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、激活炎性細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥進(jìn)展、炎癥的慢性轉(zhuǎn)歸[14]。隨著CHB患者肝臟炎癥的加重及進(jìn)展，Th17及其分泌的細(xì)胞因子也大量增加，因此Th17及其分泌的細(xì)胞因子可能是CHB中促進(jìn)肝臟炎癥進(jìn)展及損害肝細(xì)胞的影響因素之一。在體循環(huán)中，IL-17維持炎癥前環(huán)境，通過(guò)釋放粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落因子(granulocyte macrophage colony factor, GM-CSF)刺激粒細(xì)胞生成；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的激活，在外周血中釋放趨化因子5等吸引性趨化因子，大量表達(dá)中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)及產(chǎn)生免疫應(yīng)答[15]。

Treg在機(jī)體中主要體現(xiàn)為負(fù)向調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為免疫抑制、抗炎、維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，防止機(jī)體自身抗體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，避免自身免疫性疾病出現(xiàn)及在感染誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)期間過(guò)度的誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化和隨后出現(xiàn)的組織損傷。正常情況下CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)由TGFβ誘導(dǎo)分化一定數(shù)量Treg維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定；當(dāng)機(jī)體受到致病菌感染時(shí)，TGFβ與IL-6一起誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生大量Th17，導(dǎo)致炎癥發(fā)生及進(jìn)展。Treg在自身免疫性疾病、腫瘤發(fā)生與進(jìn)展、器官移植等方面廣泛參與；雷帕霉素(rapamycin, RAPA)作為一種新的免疫抑制劑，在觀察不同劑量RAPA治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠模型研究[16]中發(fā)現(xiàn),高劑量RAPA通過(guò)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)Treg擴(kuò)增來(lái)影響Th17/Treg平衡，可更好地緩解EAE小鼠的炎癥。而且大鼠肝移植相關(guān)實(shí)驗(yàn)[17]中，通過(guò)使用半乳糖凝聚素(galactosin, gal)下調(diào)NF-κB/RelB蛋白表達(dá)來(lái)干擾未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells, imDC)的成熟，促使Treg大量分化并誘導(dǎo)外周免疫耐受，用于治療移植排斥。作用方式分為兩類，第一類為分泌IL-4、IL-10及TGFβ等抑制性細(xì)胞因子，通過(guò)細(xì)胞因子作用于相關(guān)受體細(xì)胞進(jìn)行抑制作用，如通過(guò)分泌IL-10抑制T淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生細(xì)胞因子；第二類為直接與相應(yīng)細(xì)胞表面受體直接結(jié)合進(jìn)行抑制作用，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)與B7配體結(jié)合后產(chǎn)生抑制信號(hào)，抑制T淋巴細(xì)胞的活化[18]從而抑制免疫反應(yīng)。 Th17/Treg失衡可導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)破壞，進(jìn)而引起相應(yīng)的免疫性疾病，如T淋巴細(xì)胞中黑素缺乏癥會(huì)異常調(diào)節(jié)Th17與Treg平衡失調(diào)，導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎的發(fā)生[19]。

2 Th17/Treg失衡與CHB

Th17可促進(jìn)CHB患者的免疫活化，其分化頻率增加促進(jìn)肝臟炎癥進(jìn)展[20]。Treg分化頻率也呈同等趨勢(shì)，但分化程度較Th17弱，故Th17/Treg分化失衡，使得IL-6、TGFα等炎癥誘導(dǎo)因子高水平表達(dá)，大量分泌導(dǎo)致中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，加重肝細(xì)胞及肝組織炎癥進(jìn)展并引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)。Th17分化數(shù)量及所占比例升高與CHB患者血清中ALT水平升高呈正相關(guān)，但與血清中HBV DNA載量無(wú)相關(guān)性，故Th17可能促進(jìn)肝臟炎癥進(jìn)展并使病程延長(zhǎng)，而不是清除CHB患者體內(nèi)的HBV[21]。Treg分化增加可以有效阻止肝細(xì)胞及組織炎癥進(jìn)展，為減輕肝臟損傷發(fā)揮積極作用，避免組織破壞的病理性免疫應(yīng)答發(fā)生；但免疫抑制導(dǎo)致免疫逃逸也為病原體長(zhǎng)期存在提供生存空間，延長(zhǎng)慢性感染的病程，長(zhǎng)此以往使疾病病程延長(zhǎng)，并增加疾病加重及惡化風(fēng)險(xiǎn)[22]。

Th17與巨噬細(xì)胞關(guān)系密切，廣義來(lái)說(shuō)巨噬細(xì)胞可分為兩大類，一是經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1型)，被IFNγ、脂多糖(LPS)等介導(dǎo)，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、滅殺微生物和釋放多種炎癥因子等作用，表現(xiàn)為自身抗原呈遞能力上升；二是替代激活的巨噬細(xì)胞(M2型)，可分泌TGFβ和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)下調(diào)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)。HBcAg可以選擇性損害M2表型，并通過(guò)Toll樣受體2(TLR2)途徑激活M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重肝臟炎癥反應(yīng)[23]。

3 Th17/Treg失衡與肝纖維化、肝硬化

CHB患者未抗病毒治療或治療效果不佳，體內(nèi)HBV持續(xù)大量復(fù)制，使肝臟長(zhǎng)期處于慢性炎癥；炎癥是慢性肝病的標(biāo)志性病理特征，持續(xù)存在的炎癥可致使肝組織纖維化進(jìn)而發(fā)展為肝硬化。肝纖維化的特征為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的大量異常形成和累積，從而導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)的重塑。肝星狀細(xì)胞(HSC)是誘導(dǎo)肝組織纖維化發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞，HSC本身能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，可能是啟動(dòng)肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素。Sun等[24]通過(guò)小鼠四氯化碳肝組織纖維化動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg失衡與小鼠肝組織纖維化存在一定相關(guān)性，在體外Th17可促進(jìn)HSC的活化，但被Treg抑制；兩者可以相互轉(zhuǎn)化，因此糾正兩者平衡，抑制Th17和增加Treg可能為治療肝纖維化的方法之一。

Th17/Treg失衡程度與肝臟炎癥程度和纖維化程度呈正相關(guān)[25]。CHB患者體內(nèi)Th17大量分化，分泌IL-17誘導(dǎo)HSC活化和促進(jìn)肝纖維化，具體包括HSC的激活，炎癥細(xì)胞的募集，促炎和促纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)，刺激膠原合成，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和組織金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)之間的失衡[26]。機(jī)體正常情況下細(xì)胞分泌TIMP拮抗MMP破壞降解酶作用，若拮抗作用減弱或者消失，會(huì)導(dǎo)致ECM大量累積。IL-17發(fā)揮作用表現(xiàn)為，一方面誘導(dǎo)NF-κB和STAT3快速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[27]，從而激活I(lǐng)L-6和TNFα等促炎細(xì)胞因子和TGFβ等促纖維化因子的基因轉(zhuǎn)錄；另一方面直接促進(jìn)HSC增殖、TGFβ受體的上調(diào)[9]，使其表達(dá)增加。TGFβ是特征明確的促肝纖維化因子，通過(guò)兩種途徑共同作用于HSC，使之被激活，產(chǎn)生大量ECM，例如膠原蛋白、蛋白質(zhì)和糖蛋白的合成，并下調(diào)MMP表達(dá)和促進(jìn)TIMP表達(dá)來(lái)抑制ECM降解，導(dǎo)致ECM異常積蓄[28]，從而促進(jìn)ECM抑制膠原酶的分解[29]，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展，進(jìn)而發(fā)展至肝硬化。而不可溶彈性蛋白質(zhì)含量升高，提示肝硬化晚期難以逆轉(zhuǎn)[30]。CHB相關(guān)肝硬化患者中Th17/Treg比值與臨床分期密切相關(guān)，可能作為區(qū)分代償性肝硬化和非代償性肝硬化的有效指標(biāo)，不但參與發(fā)病而且與病情進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)[31]。

目前越來(lái)越多的研究表明肝硬化的發(fā)病機(jī)制涉及許多信號(hào)通路，如TGFβ/Smad (SMAD) 信號(hào)通路，大量激活的TGFβ可以激活SMAD信號(hào)通路，促使靜止的HSC轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)展為纖維化最終導(dǎo)致肝硬化[32]。微小核糖核酸(micribonuclease, miRNA)作為基因調(diào)控成員并被認(rèn)為是治療肝臟疾病的一種前景方法，引起了廣泛關(guān)注[33-34]。miR-454可以通過(guò)抑制Wnt10a的表達(dá)來(lái)抑制HSC的活化和增殖，從而抑制肝纖維化及肝硬化[35]。

4 Th17/Treg細(xì)胞失衡與HCC

盡管相關(guān)分子生物學(xué)和腫瘤治療手段取得重大進(jìn)展，HCC術(shù)后生存率有所提高，但早期遠(yuǎn)處廣泛轉(zhuǎn)移，早期診斷手段缺乏和不靈敏，局部多次復(fù)發(fā)，仍讓HCC患者總體生存率仍處于較低水平。當(dāng)HBV患者進(jìn)展至肝纖維化甚至肝硬化時(shí)，發(fā)展至HCC風(fēng)險(xiǎn)極高。

Treg/Th17失衡可致HCC患者免疫力降低，免疫耐受力下降，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。Th17通過(guò)分泌炎性細(xì)胞因子來(lái)加強(qiáng)免疫反應(yīng)，Treg分泌免疫抑制性細(xì)胞因子來(lái)抑制免疫反應(yīng)[36]。Treg抑制免疫反應(yīng)表現(xiàn)為兩方面，一方面通過(guò)抑制腫瘤內(nèi)的細(xì)胞引流局部淋巴結(jié)內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞，另一方面是阻止效應(yīng)T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。相關(guān)研究[37]表明，Treg的水平與HCC大小密切相關(guān)，腫瘤較大患者外周血中Treg的水平顯著高于腫瘤較小患者，隨著HCC的發(fā)展，Treg比例增加，提示對(duì)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，因此外周血中Treg的數(shù)量可能是HCC診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志。以上提示HCC微環(huán)境中Treg比例的減少或許會(huì)促進(jìn)腫瘤免疫治療的效果。Th17在HCC發(fā)病機(jī)制中也存在兩面性，一方面可分泌IL-6激活癌基因STAT3，上調(diào)誘導(dǎo)腫瘤血管生成的基因，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；另一方面可分泌IL-17和IFNγ，增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)的表達(dá)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)[38]。而且在肝癌病灶旁組織中可以發(fā)現(xiàn)IL-17細(xì)胞因子高表達(dá)，與肝臟微小血管密度及增生呈正相關(guān)，增加癌組織血管侵犯、臟器轉(zhuǎn)移等風(fēng)險(xiǎn)[39]；Th17及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子還隨TNM分期加重而升高，提示可能對(duì)HCC的局部免疫產(chǎn)生負(fù)面調(diào)節(jié)作用，總之Th17/Treg失衡加重HCC病情；且相關(guān)研究[40]表明，高Th17水平是腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。在膽道惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，Treg在腫瘤中心積累，表面癌細(xì)胞可能已經(jīng)能夠逃脫宿主免疫系統(tǒng)，而且癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，如IL-6和TGF-1在腫瘤微循環(huán)中誘導(dǎo)Treg異質(zhì)性，造成腫瘤的惡化，因此為了延緩腫瘤進(jìn)展，可能有必要控制Treg[41]。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSC)是存在于不同類型腫瘤中的細(xì)胞亞群，當(dāng)移植到動(dòng)物宿主中時(shí)具有自我更新、分化和致瘤能力。CSC與腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用，并受其調(diào)控，進(jìn)而激活癌細(xì)胞中的多種途徑及各種炎癥細(xì)胞因子，包括Th17細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。因此調(diào)節(jié)Th17以抑制CSC存活，是治療腫瘤的一種合理猜想，其作用途徑可通過(guò)消除與不良預(yù)后相關(guān)的Th17細(xì)胞因子引起的有害炎癥和刺激Th17細(xì)胞因子對(duì)腫瘤的抗腫瘤反應(yīng)兩個(gè)方面改善治療預(yù)后。在發(fā)現(xiàn)Th17前，阻斷IL-23、IL-1β或IL-6的治療方法在臨床上已證明有效，如阻斷IL-1β功能的IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。IL-21的抗腫瘤作用也在許多腫瘤免疫療法的臨床模型中觀察到，具有刺激細(xì)胞毒性并誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ和穿孔素的作用[42]，可使腫瘤消退甚至阻礙腫瘤生長(zhǎng)[43]。

5 Th17/Treg細(xì)胞失衡與肝衰竭

HBV相關(guān)慢性肝衰竭是在肝硬化或HCC基礎(chǔ)上出現(xiàn)的一類重型肝炎，為CHB發(fā)展至肝硬化或HCC時(shí)并發(fā)癥中較為嚴(yán)重的一種。臨床上目前主要以對(duì)癥支持治療、改善患者癥狀為主。原位肝移植是目前治療慢性肝衰竭較為有效的方法。但肝臟的配型成功率及術(shù)后免疫反應(yīng)是制約成功率的最大障礙。

在肝衰竭過(guò)程中，Th17使大量M1型巨噬細(xì)胞激活并聚集導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步發(fā)展，進(jìn)而使慢性肝衰竭加重[44]。據(jù)Zhang等[45]研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg比值與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，而且高比值也提示CHB相關(guān)的慢性肝衰竭患者預(yù)后不良；Th17升高程度與疾病嚴(yán)重程度為正相關(guān)，同時(shí)Th17水平較高也是患者死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。相關(guān)實(shí)驗(yàn)[46]表明，TGFβ導(dǎo)致小鼠急性肝功能衰竭，除了抑制肝細(xì)胞增殖外，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致總體肝細(xì)胞損傷增加，加重肝衰竭進(jìn)程，TGFβ誘導(dǎo)Th17大量分化，分泌大量炎癥因子，導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴。

間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出可塑性黏連，多譜系分化能力及多功能性基因的表達(dá)?？梢种凭奘杉?xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)促炎性M1巨噬細(xì)胞向消炎M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞表型和Treg的分化，從而使M1/M2型巨噬細(xì)胞比例和Th17/Treg平衡向抗炎狀態(tài)傾斜，抑制炎癥進(jìn)展；同時(shí)將CD4+T淋巴細(xì)胞系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為抗炎狀態(tài)，顯著改善損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和抑制肝細(xì)胞凋亡[47]，改善慢性肝衰竭患者肝臟損傷情況，可為改善慢性肝衰竭患者癥狀提供潛在性治療作用[48]。

6 展望

目前CHB治療方案主要為服用核苷酸類似物，可在HBV復(fù)制時(shí)作為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circledna, cccDNA)復(fù)制的替代模板，使病毒復(fù)制失效，但是不能對(duì)cccDNA產(chǎn)生作用，無(wú)法徹底清除HBV，患者需長(zhǎng)期服藥甚至終生服藥。因此單純依靠核苷酸類似物難以徹底治愈CHB，為達(dá)到臨床治愈需加用免疫調(diào)節(jié)制劑，如IFN等，提高患者機(jī)體自身免疫力，并且使機(jī)體免疫系統(tǒng)重建。

Th17和Treg源于輔助T淋巴細(xì)胞，是人體免疫系統(tǒng)重要構(gòu)成部分。二者失衡在HBV相關(guān)肝臟疾病中持續(xù)存在，且在每個(gè)階段中扮演角色各不相同。詳細(xì)了解由CHB進(jìn)展至HCC、肝衰竭中每個(gè)階段Th17和Treg失衡具體情況，依據(jù)失衡情況了解病情變化，找到新的治療方案及治療介入最佳時(shí)機(jī)具有重要意義。故深入研究HBV相關(guān)肝臟疾病病程中以輔助T淋巴細(xì)胞為首的免疫細(xì)胞變化過(guò)程及結(jié)果，可為疾病的治療提供新方案，并為開(kāi)發(fā)新型藥物及選擇不同藥物治療提供可能性。

作者貢獻(xiàn)聲明：唐光俊負(fù)責(zé)文獻(xiàn)閱讀，撰寫(xiě)論文；劉懷鄂、彭玉娟負(fù)責(zé)提供意見(jiàn)并修改；游晶負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。