劉晨霞， 常 凱， 那琬琳， 王艷艷， 牟 東， 李 華， 江忠勇， 劉 媛， 熊 杰

1 西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院， 四川 瀘州 646000； 2 西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 a.檢驗科， b.消化科， c.腫瘤科， 成都 610083

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2010年—2017年西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院HCC切除術(shù)后5年預(yù)后良好肝癌組織(n=6)和手術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)患者的肝癌組織(n=6)?；颊吲懦悄虿?、冠心病、高血脂、高血壓、腎病和自身免疫性疾病?；颊叩?次肝癌切除術(shù)中肝癌組織置于保護液放入液氮中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取 將待測樣品置于裂解緩沖液中，冰浴超聲勻漿器處理，收集上清液備用[8]。

1.2.2 蛋白質(zhì)消化和TMT標記 使用Thermo Scientific 的BCA蛋白測定試劑盒及TMT蛋白標記試劑盒，根據(jù)說明書消化酶切標記合成肽混合物于室溫2 h，標記好的樣本進行真空干燥備用。

1.2.3 HPLC-MS/MS分析 在緩沖液(20 mmol/L甲酸銨水溶液)中溶解肽混合物，Ultimate 3000高效液相系統(tǒng)(Thermo Fisher scientific, MA, USA)進行分離。流動相為5%～45%線性梯度，20 mmol/L甲酸鈉(溶劑：80%乙腈)，流速1 ml/min，分離12個餾分。

肽段分餾組分用含0.1%甲酸的超純水分別溶解，10 μl樣品上樣過色譜柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18, 100 μm×2 cm)，流速10 μl/min。隨后線性梯度2%～40% D液(含0.1%甲酸的乙腈)分別經(jīng)分析柱(Acclaim PepMap C18, 75 μm×15 cm)70 min，流速300 nl/min。

1.2.4 靶基因分析 在數(shù)據(jù)庫miRbase和NCBI中收集各物種已知成熟的has-miR-152-3p序列，應(yīng)用VectorNTI對該序列在各物種之間進行同源性分析[9]。采用TargetScan、picTar、microT、PITA、miRmap和miRanda 6個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測has-miR-152-3p的靶基因及轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.5 生物信息學分析 采用Gene Ontology(GO)和DAVID數(shù)據(jù)庫對has-miR-152-3p預(yù)測的靶基因集合進行富集分析和基于REACTOME數(shù)據(jù)庫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。應(yīng)用GAD disease和OMIM disease兩個疾病數(shù)據(jù)庫進行疾病富集；應(yīng)用CGAP EST QUARTILE進行組織富集分析；應(yīng)用BIOGRID INTERACTION進行蛋白互作分析。以P<0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計學意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和疾病通路[10]。

除了對本業(yè)的專注以外，韋俊賢表示，國家為民族企業(yè)騰飛帶來了巨大機遇，而回報社會是民族企業(yè)應(yīng)具備的責任擔當。

1.2.6 突變率分析及生存曲線分析 應(yīng)用TCAG數(shù)據(jù)庫和GDC數(shù)據(jù)庫，采用群組分析研究方法調(diào)取與肝臟組織有關(guān)目的基因的所有基因突變和生存率分析相關(guān)數(shù)據(jù)10 202例，以AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1基因為篩選條件，共發(fā)現(xiàn)有關(guān)研究項目153例。逐一下載相關(guān)研究序列信息，分析其單群組單基因生存曲線、突變類型和突變頻率；再分析多群組多基因聯(lián)合的生存曲線、突變類型和突變頻率。

1.3 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審批，所納入患者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 靶基因預(yù)測與GO分析 應(yīng)用TargetScan、picTar、PITA、miRmap、microT和miRanda 6個數(shù)據(jù)庫抓取的靶基因分別為655、413、2522、1304、1128和1035個。應(yīng)用媒介嚴格控制方法(CLIP數(shù)據(jù)≥2)篩選得到3714個靶基因。

將>2個數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的3174個候選靶基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)miR-152-3p的靶基因主要富集在核質(zhì)、細胞質(zhì)和細胞溶質(zhì)等區(qū)域(P<0.01)。分子功能主要富集在蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、細胞黏附等分子功能中(P<0.01)。涉及細胞間黏著、細胞周期停滯、細胞黏附調(diào)節(jié)等主要生物學進程(P<0.01)(表1)。將GO富集分析后的生物學對應(yīng)事件進行比例分析如圖1[11]。

注：a，GO生物學進程分布圖；b，GO分子功能分布圖；c，GO細胞成分分布圖。

2.2 TMT標記定量蛋白質(zhì)組學檢測與分析 應(yīng)用RT-PCR檢測經(jīng)HCC切除術(shù)后5年預(yù)后良好和手術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)患者肝癌組織的miR-152-3p表達水平。RT-PCR檢測表明肝癌復(fù)發(fā)組的miR-152-3p相對表達量(0.047±0.022)明顯低于預(yù)后良好組(0.231±0.154，t=5.973，P<0.001)。應(yīng)用TMT技術(shù)標記肝癌組織后經(jīng)LC-MS/MS檢測分析獲得肽段42 029個，結(jié)合miR-152-3p候選靶基因分析得到顯著性差異表達蛋白質(zhì)17個，其中ROBO1、MCM3、MET、MRPL28、SHC1、TMTC3、STAU1、FOXRED1、MMS19、BCCIP、MTMR12、AKAP1、MRPL50在術(shù)后復(fù)發(fā)組中蛋白質(zhì)表達量降低；而CAP1、HLA-C、RTN4、SLC44A2蛋白質(zhì)表達量升高(P值均<0.05)(圖2)。

圖2 TMT全蛋白組學定量檢測分析miR-152-3p靶蛋白質(zhì)的表達差異

2.3 靶基因GO富集分析 將TMT蛋白測序得到的17個受miR-152-3p調(diào)控的靶基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集在線粒體和質(zhì)膜區(qū)域。分子功能主要富集在Poly(A)RNA結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能中。涉及線粒體翻譯延伸/終止和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)兩大生物學進程(表1)。

表1 miR-152-3p靶蛋白的GO富集分析結(jié)果

2.4 靶基因的相關(guān)代謝通路富集分析 基于REACTOME pathway方法對miR-152-3p靶基因進行富集分析。ROBO1和CAP基因參與Slit/Robo信號通路；MRPL28和MRPL50參與線粒體翻譯的起始、終止和延伸途徑。信號通路均與癌癥復(fù)發(fā)機制關(guān)系密切(表2)。

表2 miR-152-3p靶蛋白的相關(guān)信號通路富集分析結(jié)果

2.5 靶基因的相關(guān)疾病富集分析 基于GAD disease和OMIM disease兩個疾病數(shù)據(jù)庫，對miR-152-3p靶基因進行富集分析[12]。結(jié)果顯示蛋白質(zhì)定量性狀位點富集分值最高；其次為獲得性免疫缺陷綜合征、頭頸癌和乳腺癌(表3)。

表3 miR-152-3p靶基因的相關(guān)疾病富集分析結(jié)果

2.6 靶基因的組織定位富集分析 SHC1、BCCIP、TMTC3、MCM3、AKAP1 5個基因富集在正常胎盤組織中；ROBO1、SLC44A2等基因富集在正常結(jié)腸組織；CAP1、HLA-C等基因富集在正常脾組織中(表4)。然而正常胎盤組織表達的基因在肝癌組織中出現(xiàn)，說明SHC1、BCCIP、TMTC3、MCM3、AKAP1基因具有促進激活細胞增殖、分裂等能力，與腫瘤的增殖復(fù)發(fā)關(guān)系密切。

表4 miR-152-3p靶蛋白的組織定位富集分析結(jié)果

2.7 靶基因的多重富集分析及驗證 多重富集分析發(fā)現(xiàn)miR-152-3p靶基因主要作用于肝癌細胞的線粒體呼吸鏈，參與蛋白為AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1，其可能的調(diào)控模式如圖3。

圖3 miR-152-3p靶蛋白參與呼吸鏈調(diào)控的預(yù)測途徑

基因突變及突變后生存曲線分析結(jié)果表明：上述蛋白的功能缺失或減弱會嚴重影響患者的預(yù)后生存率。SHC1和AKAP1的體細胞突變頻率較高，均為3.33%，STAU1在該組隊研究中未發(fā)現(xiàn)體細胞突變。SHC1和AKAP1發(fā)生拷貝數(shù)變異增加的頻率也相對較高，分別為48.68%和17.11%。發(fā)生拷貝數(shù)變異減少頻率較高的基因是FOXRED1，為16.45%(表5)。臨床生存率分析研究表明：SHC1基因突變后的5年生存率為22%，線粒體呼吸鏈相關(guān)6個基因多群組研究分析其5年生存率為41%。無論單基因群組研究，還是多基因群組分析均表明，線粒體呼吸鏈相關(guān)的6個基因功能發(fā)生改變時均會嚴重影響生存率(圖4)。

圖4 miR-152-3p作用于線粒體呼吸鏈相關(guān)基因的突變率及生存曲線分析

表5 miR-152-3p作用于線粒體呼吸鏈相關(guān)基因的突變頻率統(tǒng)計表

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)miR-152-3p在HCC中的表達程度較低，表明miR-152-3p可能在肝癌的發(fā)生和進展中具有抑制腫瘤的能力[12-13]。Dang等[14]發(fā)現(xiàn)miR-152-3p的下調(diào)程度與HCC的臨床分期有關(guān)。晚期Ⅲ、Ⅳ期患者miR-152-3p表達明顯低于Ⅰ、Ⅱ期(P值均<0.05)。腫瘤體積越大，miR-152-3p的表達越低，表現(xiàn)為腫瘤的生長和惡化[15]。因此，已有的研究結(jié)果揭示了miR-152-3p與肝癌進展的關(guān)系緊密，檢測miR-152-3p的表達對臨床預(yù)測HCC的進展和預(yù)后具有重要價值，然而其具體的調(diào)控機制、信號通路及作用位點并不明確。

該研究中發(fā)現(xiàn)miR-152-3p靶基因主要作用在線體呼吸鏈中，參與調(diào)控的靶蛋白AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1在肝癌復(fù)發(fā)組中均不同程度降低。但已有研究表明在腫瘤分化與增殖過程中線粒體呼吸鏈的活躍程度增高，上述6個呼吸鏈相關(guān)蛋白在肝癌組織中的表達量均高于癌旁組織。腫瘤干細胞是腫瘤細胞中存在的小部分具有無限自我更新和多向分化潛能的細胞亞群，是腫瘤復(fù)發(fā)、惡性轉(zhuǎn)移的細胞學根源。腫瘤干細胞時刻維持較低的細胞氧化代謝水平，待到時機成熟進行大量的增殖分化。因此，筆者認為在肝癌復(fù)發(fā)組中呼吸鏈相關(guān)蛋白表達量較低從某種程度上反映了腫瘤干細胞的比例較高，肝癌復(fù)發(fā)的可能性較大。

在受miR-152-3p調(diào)控的靶蛋白中，F(xiàn)OXRED1作為呼吸鏈NADH脫氫酶的裝配因子，可調(diào)節(jié)呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的功能，進而影響包括誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和mtDNA突變所致的損傷[16]；AKAP1是重要的線粒體調(diào)節(jié)蛋白，對線粒體氧化呼吸和活性氧自由基的生成有增強作用[17]；MRPLs(MRPL50/L28)是合成線粒體核糖體大亞基的成員，影響下游線粒體蛋白的翻譯和呼吸鏈復(fù)合體的合成[18]。SHC1和STAU1可與HSP70相互作用抑制凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)從線粒體的釋放，AIF作為雙功能蛋白酶，具有氧化還原活性和促進凋亡活性[19]。AIF作為氧化還原酶，是呼吸鏈復(fù)合體的直接構(gòu)成元件，還是僅影響呼吸鏈復(fù)合體 Ⅰ 的組裝及其穩(wěn)定性仍有待進一步研究[20]。這6個蛋白與線粒體呼吸鏈的結(jié)構(gòu)構(gòu)成、氧化分解和能量釋放直接相關(guān)，是肝癌細胞線粒體氧化呼吸的重要調(diào)控因子。本研究中分析的基因突變率和生存曲線也反映出這6個基因?qū)毎吧飩€體的影響。

綜上，miR-152-3p主要通過調(diào)控靶基因AKAP1、FOXRED1、MRPL28、MRPL50、SHC1、STAU1作用于線粒體呼吸鏈，影響細胞氧化呼吸功能導(dǎo)致HCC復(fù)發(fā)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：劉晨霞、常凱、江忠勇負責課題設(shè)計、資料分析、撰寫論文；那琬琳、王艷艷、牟東、李華參與收集數(shù)據(jù)、修改論文；劉媛、熊杰負責擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。