洪瑩暉， 葉明亮， 羅 杰， 王 純， 劉佳良， 任 超，藍(lán)偲瑜， 趙 秋， 常 瑩

1 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 消化內(nèi)科， 武漢 430071； 2 湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心， 武漢 430071；

3 腸病湖北省重點(diǎn)實驗室， 武漢 430071

肝細(xì)胞癌具有新發(fā)病例多、死亡率高、預(yù)后極差的特征，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要事件[1]。促癌基因Yap1作為Hippo通路的經(jīng)典核效應(yīng)器，在細(xì)胞增殖、分化等多種生物進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的同時，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用[2]。近年來發(fā)現(xiàn)Yap1在肺癌、乳腺癌、食管癌、胃腸癌等多種癌癥中明顯上調(diào)，發(fā)揮促癌效應(yīng)[3-4]。

丹參酮ⅡA是一種提取自傳統(tǒng)中草藥丹參根莖的復(fù)合物，具有改善血液循環(huán)、血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)、護(hù)肝等多種藥效，并且能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮廣譜抗癌特性[5]，其主要依賴p53途徑發(fā)揮促癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)。例如在鼻咽癌中，丹參酮ⅡA通過p53調(diào)控細(xì)胞周期蛋B1抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[6]；急性白血病中丹參酮ⅡA通過激活p53聯(lián)合伊馬替尼促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。最近有研究[8]發(fā)現(xiàn)在癌癥的發(fā)展階段，丹參酮ⅡA對于癌細(xì)胞的侵襲遷移也具有抑制效應(yīng)，如在結(jié)腸癌中，丹參酮ⅡA能明顯抑制SW620的侵襲遷移。而其在肝癌的增殖、遷移等惡性表型中發(fā)揮作用的相關(guān)研究較少。本實驗通過沉默促癌基因Yap1聯(lián)合丹參酮ⅡA研究二者對肝癌細(xì)胞株Huh-7增殖、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及標(biāo)本收集 人肝癌細(xì)胞Huh-7、Hep-G2、HCCL-M3以及人相對正常肝上皮細(xì)胞株L02購買自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞平臺。采用完全培養(yǎng)基[含10%的胎牛血清(Gibco. 美國)、DMEM(Gibco)、 青-鏈霉素抗生素]37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。10對人肝細(xì)胞癌及癌旁組織標(biāo)本來源于武漢大學(xué)中南醫(yī)院，標(biāo)本經(jīng)外科手術(shù)切除后立即于-80 ℃儲存，以用于后續(xù)實驗研究，收集時間2019年6月1日—2019年12月1日。標(biāo)本疾病類型及質(zhì)量經(jīng)病理科校驗。

1.2 藥物及細(xì)胞處理 丹參酮ⅡA購買自中國藥品生物制品檢定所 (YZ-110766)，高效液譜色相法(HPLC)檢測藥品純度≥ 98%。丹參酮ⅡA溶于二甲基亞砜(DMSO，Sigma)中，工作液濃度選用2 mmol/L，DMSO稀釋分別得到濃度梯度為0、2.5、5、10、15、20 μmol/L，處理肝癌細(xì)胞Huh-7 24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗，藥物-20 ℃避光保存。

1.3 RNA的提取及相對定量 Life Trizol RNA分離試劑購買自Invitrogen公司，按說明書步驟收集RNA沉淀并用DEPC水溶解，Nanodrop2000測所得RNA的濃度與純度。RNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自Toyobo公司(日本)，按說明書方法得到cDNA，UltraSYBR Mixture購買自北京康為生物科技有限公司，按2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。實驗所涉及的基因引物如下，Yap1：GAACTCGGCTTCAGGTCCTC(F)，GGTTCATGGCAAAACGAGGG(R)；GAPDH：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG(F)， GCAGGAGGCATTGCTGATGA(R)。

1.4 蛋白的提取及蛋白質(zhì)印跡 蛋白提取試劑采用含有PMSF的Ripa裂解緩沖液(碧云天)，按說明書步驟進(jìn)行操作。蛋白濃度測定采用BCA蛋白測定試劑盒(碧云天)。蛋白上樣緩沖液變性蛋白用于蛋白質(zhì)印跡上樣，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜，二抗封閉1.5 h，采用普通ECL顯影液GENESys顯影儀顯影。實驗涉及的抗體如下：Anti-Yap1(CST) 1∶1000，Anti-E-cad (CST) 1∶1000，Anti-Vimentin(CST) 1∶1000，Anti-GAPDH(abcam) 1∶1000，Anti-Bcl2(abcam) 1∶1000，Anti-Bax(abcam) 1∶1000，山羊抗兔IgG(Abbkine) 1∶4000，山羊抗鼠IgG(Biovison) 1∶8000。

1.5 細(xì)胞增殖試驗(MTT法) MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購買自上海碧云天公司(C0009)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，96孔板每孔加入200 μl完全培養(yǎng)基，大約4000個細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)24 h，用濃度梯度0、2.5、5、10、15、20 μmol/L處理細(xì)胞24 h，同時設(shè)置對照孔與空白孔用于計算調(diào)零。24 h后換液，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)大約4 h，每孔加入100 μl Formazan溶解液，適當(dāng)振搖，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h充分溶解紫色結(jié)晶。于570 nm下測定吸光度。計算如下：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(1-實驗組OD值/對照組OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購買自貝博(#BB-4101)。取對數(shù)生長期細(xì)胞鋪于6孔板，24 h后待細(xì)胞融合至70%左右，分別給予轉(zhuǎn)染si-NC、丹參酮ⅡA、si-Yap1以及si-Yap1聯(lián)合丹參酮ⅡA處理，24 h后收集細(xì)胞，按說明書步驟操作，進(jìn)行FITC及PI雙染，立即上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 細(xì)胞遷移侵襲實驗 細(xì)胞遷移實驗(康寧)選用濾膜孔徑8.0 μm的小室，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于6孔板，24 h后轉(zhuǎn)染si-Yap1與7.8 μmol/L丹參酮ⅡA共處理細(xì)胞，si-NC組作為對照，8 h換液，(給藥24 h后)胰酶消化細(xì)胞鋪于小室，大約4萬個細(xì)胞/小室。細(xì)胞侵襲實驗同遷移實驗區(qū)別在于小室需要用0.3 mg/ml的Matrigel(康寧)預(yù)處理，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置凝固3～4 h后小室方可進(jìn)行后續(xù)實驗。24 h后4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，棉簽擦去小室上層細(xì)胞，100倍、200倍視野下隨機(jī)選取3個視野拍照計數(shù)分析。

1.8 倫理學(xué)審查 人體標(biāo)本獲取獲得湖北省實驗研究倫理委員會批準(zhǔn)，批號：科倫快審2018078。人肝細(xì)胞癌及癌旁組織標(biāo)本所涉及患者均已簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 肝癌中Yap1表達(dá)上調(diào)以及轉(zhuǎn)染si-Yap的沉歪默抑制效率 10對人肝細(xì)胞癌和對應(yīng)癌旁標(biāo)本進(jìn)行蛋白印跡檢測，8對標(biāo)本Yap1在癌中的表達(dá)高于癌旁組織(圖1)。對比人正常肝細(xì)胞L02和肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh-7、HCCL-M3中Yap1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Yap1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)增高，其中在Huh-7中表達(dá)最高(圖2)。設(shè)計合成的3對si-Yap1序列分別瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)mRNA和蛋白水平si-Yap1-3沉默Yap1表達(dá)效果明顯，蛋白水平沉默效率達(dá)到87.004%(表1)，mRNA水平沉默效率達(dá)到53.558%(表2)，因此選擇第3條si-Yap1(si-Yap1-3)進(jìn)行后續(xù)實驗(圖3)。

表1 si-Yap1瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞灰度值分析

表2 si-Yap轉(zhuǎn)染Huh-7后mRNA水平抑制Yap1的表達(dá)

注：B，癌旁標(biāo)本；T，肝癌標(biāo)本。

圖2 基因Yap1在不同細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平

圖3 si-Yap1瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞Yap1的表達(dá)水平

2.2 丹參酮ⅡA抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲 實驗分別采用0、2.5、5、10、15、20 μmol/L 6個濃度處理肝癌細(xì)胞Huh-7，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT檢測，結(jié)果顯示隨著丹參酮ⅡA濃度增高，肝癌細(xì)胞Huh-7的細(xì)胞增殖被逐漸抑制，藥物處理24 h后丹參酮ⅡA的半數(shù)抑制濃度(IC50)為8.683 μmol/L(圖4)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)作為腫瘤細(xì)胞獲得遷移侵襲能力的一大重要途徑，其特征在于細(xì)胞表面上皮E-鈣黏蛋白(E-cad)的表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)增高。不同濃度的丹參酮ⅡA處理細(xì)胞24 h收集蛋白，檢測下游EMT相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，E-cad表達(dá)增加，Vimentin表達(dá)減少(圖5)。同時，Bcl-2和Bax作為細(xì)胞凋亡過程中一對作用相反的明星蛋白分子，其比例決定了細(xì)胞的存亡。不同藥物處理下，抑制凋亡分子Bcl-2的表達(dá)逐漸減少，而促凋亡分子Bax的表達(dá)增高(圖5)。

圖4 不同藥物濃度作用于Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率

圖5 不同藥物濃度作用于Huh-7細(xì)胞下游表型相關(guān)分子表達(dá)變化

2.3 沉默促癌基因Yap1聯(lián)合丹參酮ⅡA對于肝癌細(xì)胞株Huh-7增殖、凋亡、遷移的影響 采用si-Yap1聯(lián)合不同濃度的丹參酮ⅡA處理細(xì)胞24 h之后進(jìn)行MTT檢測，結(jié)果顯示，聯(lián)合處理細(xì)胞其IC50為7.867 μmol/L(圖6)。聯(lián)合濃度為7.867 μmol/L的丹參酮ⅡA和si-Yap1-3共同處理肝癌細(xì)胞Huh-7。檢測下游凋亡情況如圖7所示，si-Yap1聯(lián)合丹參酮ⅡA處理組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增高，而Bcl-2表達(dá)降低。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，聯(lián)合處理組早凋細(xì)胞占比率增高(25.98% vs 9.21%，χ2=4.078，P<0.05)(圖8)。聯(lián)合組E-cad表達(dá)增高，而Vimentin表達(dá)減少證實聯(lián)合處理組細(xì)胞的遷移侵襲能力降低(圖7)。Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組比si-NC組細(xì)胞遷移(43.19±2.88 vs 132.20±10.03，t=8.527，P=0.001)及侵襲(53.95±4.20 vs 179.10±11.11，t=4.484，P=0.011)能力明顯降低(圖9、10)。

圖6 si-Yap1-3與藥物共處理Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率

圖7 si-Yap1-3和丹參酮ⅡA聯(lián)合處理下游表型相關(guān)分子變化

圖8 不同處理下Huh-7的細(xì)胞凋亡變化情況

注：a，×100；b，×200。

3 討論

肝癌作為全世界排名第二的致死癌癥，其有效的治療手段十分有限。超過半數(shù)的肝癌患者由于確診時已經(jīng)處于疾病的晚期階段，而喪失了接受如肝切除、肝移植等治愈性治療措施的機(jī)會[9]。索拉非尼和樂伐替尼作為多激酶抑制劑是目前公認(rèn)的肝細(xì)胞癌治療靶向藥物，延長患者中位生存期3～4個月，療效難以滿意[10]。肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是縮短肝細(xì)胞癌患者生存期與治療后復(fù)發(fā)的主要原因，腫瘤的微環(huán)境有助于腫瘤細(xì)胞獲得浸潤型表型，EMT這一過程是公認(rèn)的賦予癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的重要途徑，尤其是E-cad的缺失[11]。監(jiān)測相關(guān)指標(biāo)的變化對于判斷癌細(xì)胞的遷移侵襲能力有指導(dǎo)性意義。Hippo通路的經(jīng)典核效應(yīng)器Yap1不僅在正常細(xì)胞增殖、器官發(fā)育中維持細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞骨架，同時與Wnt通路以及TGFβ等多條通路相互聯(lián)合，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[12]。在癌癥的發(fā)展中，Yap1的表達(dá)變化以及核質(zhì)穿梭協(xié)同癌細(xì)胞的變形和遷移[13]。丹參酮ⅡA作為中草藥的提取混合物，以往研究[6]證實其在促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡并抑制腫瘤生長。本研究通過聯(lián)合沉默促癌基因Yap1和丹參酮ⅡA觀察其對于肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力的影響。其中MTT的實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖減慢且藥物的有效半數(shù)抑制濃度降低。下游的凋亡相關(guān)標(biāo)志物以及流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組細(xì)胞早期凋亡率明顯增加，凋亡進(jìn)程被促進(jìn)。通過檢測EMT相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示Yap1沉默聯(lián)合藥物丹參酮ⅡA明顯下調(diào)Vimentin表達(dá)，E-cad表達(dá)增加，提示細(xì)胞遷移侵襲能力減弱。Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實驗進(jìn)一步證實了這一點(diǎn)。綜上所述，沉默促癌基因Yap1聯(lián)合丹參酮ⅡA能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh-7增殖、凋亡及侵襲遷移的進(jìn)展，為肝癌藥物的進(jìn)一步臨床研究提供了方向。

注：a，×100；b，×200。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：洪瑩暉、葉明亮負(fù)責(zé)課題設(shè)計，實驗操作以及資料分析，撰寫論文；羅杰、王純、任超、藍(lán)偲瑜、劉佳良參與修改論文；洪瑩暉、趙秋、常瑩負(fù)責(zé)擬定寫作思路，撰寫文章并最后定稿；趙秋、?，撎峁┵Y金支持。