李萌浩， 李 凱， 湯世豪， 王鉦鈺， 郭文剛， 殷占新， 韓國宏

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院 消化介入科， 西安 710032

肝性腦病(HE)是繼發(fā)于肝臟嚴(yán)重疾病所出現(xiàn)的以代謝紊亂為基礎(chǔ)、輕重程度不同的神經(jīng)精神異常綜合征[1-2]。輕微肝性腦病(MHE)是HE癥狀最輕微的階段，可降低患者生活質(zhì)量，增加顯性腦病(OHE)發(fā)生率和死亡風(fēng)險。慢性肝硬化患者中MHE的患病率高達(dá)80%[3]，住院肝硬化患者隱匿性HE的發(fā)病率為39.9%[4]。研究表明，肝硬化患者腸道菌群發(fā)生明顯改變[5-7]，腸道菌群失調(diào)隨肝硬化嚴(yán)重程度加重而加重[8]。OHE患者和MHE患者的腸道菌群具有特征性變化，如有益菌/原生菌群減少，而有害菌/潛在致病菌增多等[9]。

經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體分流術(shù)(TIPS)是降低門靜脈壓力最有效的方式之一，可顯著控制再出血率，減輕腹水程度，但是HE作為TIPS術(shù)后最主要的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響術(shù)后患者的生活和生存質(zhì)量[1]。由于缺乏重視，TIPS術(shù)前很少對患者進(jìn)行MHE檢測，那么MHE患者TIPS術(shù)后預(yù)后如何，是否與腸道菌群的改變有關(guān)成為一個值得探討的問題。因此，本文通過高通量測序方法，分析TIPS術(shù)后不同預(yù)后的患者其腸道菌群與術(shù)前的差異，探索從菌群角度預(yù)防和治療MHE患者TIPS術(shù)后腦病的新策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年7月—2017年7月在本院接受TIPS治療的MHE患者。MHE的診斷根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會制定的《肝硬化肝性腦病診療指南》[10]，術(shù)前1～3 d及術(shù)后1個月對患者進(jìn)行傳統(tǒng)紙-筆神經(jīng)心理學(xué)測試:HE心理學(xué)評分，包括數(shù)字連接試驗(yàn)(NCT) A、B,數(shù)字符號試驗(yàn)(DST),軌跡描繪試驗(yàn),系列打點(diǎn)試驗(yàn)5個子測試試驗(yàn)。若NCT-A、DST均陽性，或5個子試驗(yàn)中任何2項(xiàng)異常，即診斷為MHE。OHE診斷根據(jù)West-Haven標(biāo)準(zhǔn)及分級[11]。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)經(jīng)臨床/實(shí)驗(yàn)室檢查，影像學(xué)檢查或肝活檢確診為肝硬化；(2)計(jì)劃接受TIPS治療以預(yù)防門靜脈高壓性靜脈曲張?jiān)俪鲅?3)術(shù)前檢測為MHE患者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)肝臟及胃腸道惡性腫瘤；(2)術(shù)前腹瀉、血便、便秘；(3)術(shù)前HE病史；(4)未控制的嚴(yán)重活動性感染(>2級)或敗血癥；(5)嚴(yán)重的心、腎、肺功能不全；(6)曾接受TIPS或手術(shù)分流史；(7)布加綜合征；(8)入組前3個月胃腸道手術(shù)史；(9)近期計(jì)劃肝移植手術(shù)；(10)懷孕或哺乳期受試者。

1.4 研究方法 分別于術(shù)前1～3 d和術(shù)后1個月收集糞便樣本及采樣時臨床資料信息。采樣前1 d囑患者清淡飲食，使用無菌采樣管收集新鮮糞便，液氮速凍后在超凈工作臺上預(yù)處理，取采樣管中心部位樣本3～5 g于樣本管中，存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。并于采樣當(dāng)天記錄患者的臨床資料信息。根據(jù)患者術(shù)后1個月內(nèi)發(fā)生HE的類型進(jìn)行分組。

1.5 糞便微生物DNA提取、鑒定以及16S rRNA高通量測序 糞便微生物DNA提取、鑒定以及16S rRNA 測序由上海態(tài)昌基因科技有限公司完成。糞便樣本DNA提取采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit (Omega Bio-tek,Inc.,美國)，采用熱循環(huán)PCR系統(tǒng)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4超變區(qū)，引物序列為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，PCR反應(yīng)采用EasyCycler 96 PCR 擴(kuò)增儀 (Analytik Jena Corp.,德國) 完成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化后，安裝如上擴(kuò)增方法完成8個循環(huán)的index擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣本的index標(biāo)簽不重復(fù)。將產(chǎn)物進(jìn)行純化后，按照等摩爾比進(jìn)行混合，并采用Illumina Miseq平臺 (Illumina Inc.,美國) 根據(jù)官方說明書操作完成測序(每個糞便樣本至少完成2萬條測序數(shù)據(jù))。

1.6 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由西京醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會審批，批號：KY20172061-1，患者均簽署知情同意書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分析SPSS 19.0和R v3.6.1 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用M(P25～P75)表示,3組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，采用Bonferroni法進(jìn)行多個樣本的多重比較；同組患者術(shù)前術(shù)后的比較采用Wilcoxo符號秩檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。微生物組Beta分析基于Bray Curtis距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，使用Adonis法(PerMANOVA)對比組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入接受TIPS治療的MHE患者28例，術(shù)前患者中位年齡51歲，男13例，女15例，中位MELD評分13分，Child-Pugh分級A/B/C級分別9/15/4例。根據(jù)患者術(shù)后1個月內(nèi)發(fā)生HE的類型分為3組：無HE組(n=8，28.6%)、MHE組(n=12，42.8%)和OHE組(n=8，28.6%)。3組患者術(shù)前臨床資料均未見明顯差異(P值均>0.05)(表1)。

表1 不同預(yù)后組術(shù)前基線特征比較

2.2 物種組成分析 總體患者的腸道菌群主要由5個優(yōu)勢菌門(平均相對豐度占比>1%)組成：厚壁菌門(45.0%)、擬桿菌門(30.6%)、變形菌門(17.2%)、放線菌門(4.78%)和疣微菌門(1.9%)。菌門水平3組間比較無明顯差異，且術(shù)后未見明顯改變(P值均>0.05)。

2.3 Alpha多樣性指數(shù)分析 Alpha多樣性包括Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，對比發(fā)現(xiàn)，術(shù)前3組患者的alpha多樣性無明顯差異(P值均>0.05)(表2)，術(shù)后各組alpha多樣性無明顯改變且3組間無明顯差異(P值均>0.05)。

表2 不同預(yù)后組術(shù)前alpha多樣性比較

2.4 Beta多樣性指數(shù)分析 基于Bray Curtis距離矩陣的PCoA分析顯示，3組間beta多樣性在術(shù)前和術(shù)后沒有明顯差異?？v向?qū)Ρ戎校瑑HMHE組術(shù)前和術(shù)后的beta多樣性明顯改變(PerMANOVA法，F(xiàn)=2.71，P=0.049)(圖1)。

注：基于Bray Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析，MHE組術(shù)前術(shù)后beta多樣性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.71，P=0.049)。

2.5 物種差異分析 無HE組患者TIPS術(shù)后相比術(shù)前，原生菌群小桿菌屬(Z=2.521，P=0.012)、 糞球菌屬(Z=2.1，P=0.036)、解黃酮菌屬(Z=2.1，P=0.036)、瘤胃菌科某屬(Z=2.1，P=0.036)和狹義梭菌屬(Z=1.96，P=0.049)相對豐度顯著升高。原生菌假丁酸弧菌屬(Z=1.859，P=0.063)、有害菌如丹毒絲菌科未知屬(Z=1.82，P=0.069)和顆粒鏈菌屬(Z=1.82，P=0.069)相對平度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MHE組患者術(shù)后部分有害菌顆粒鏈菌屬(Z=2.521，P=0.012)、腸球菌屬(Z=2.51，P=0.012)、鏈球菌屬(Z=2.432，P=0.015)和羅氏菌屬(Z=2.001，P=0.045)豐度明顯減低，而部分有害菌韋榮球菌屬(Z=2.353，P=0.019)和巨球菌屬(Z=1.955，P=0.05)則明顯升高。

對于OHE組患者，僅有韋榮球菌屬(Z=2.38，P=0.017)豐度顯著升高，其他菌群豐度未見明顯變化(圖2)。

圖2 不同預(yù)后組TIPS術(shù)前術(shù)后腸道菌群變化情況

采用增長倍數(shù)(術(shù)后菌群相對豐度/術(shù)前菌群相對豐度，豐度為0則按10-6計(jì)算)來描述菌群術(shù)后的變化量，對比發(fā)現(xiàn)，糞球菌屬的變化量在3組間具有明顯差異[無HE組 vs MHE組 vs OHE組：2.00(1.11～91.61) vs 1.21(0.26～6.79) vs 0.09(0.01～0.92)，χ2=6.249，P=0.043](圖3)。

注：3組間菌群變化量有明顯差異(χ2=6.249，P=0.043)，球菌屬變化量在無HE組和MHE組中均明顯高于OHE組(P值分別為0.021、0.050)，而無HE組與MHE組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

本研究通過16S rRNA測序的方法，開展了一項(xiàng)縱向觀察性研究。描述MHE患者經(jīng)TIPS術(shù)后不同腦病狀態(tài)的患者腸道菌群的變化，探索術(shù)后菌群的改變與術(shù)后腦病程度關(guān)系。

TIPS術(shù)后，3組患者腸道菌群的alpha多樣性無明顯差異，總體菌群組成相似，可能與肝硬化失代償期患者較差的菌群狀態(tài)有關(guān)。術(shù)后無HE組患者，菌群失調(diào)好轉(zhuǎn)，小桿菌屬、糞球菌屬、解黃酮菌屬、瘤胃菌科某屬、狹義梭菌屬和假丁酸弧菌屬增多，這些菌屬多屬于毛螺菌科和瘤胃菌科，是健康人體內(nèi)的原生菌群，它們參與人腸道內(nèi)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，減輕結(jié)腸炎癥[12-15]，且與致病菌競爭營養(yǎng)，產(chǎn)生抗菌肽，可能改善腸道屏障[16-18]。這在克羅恩病和肝硬化的研究中均有所體現(xiàn)[17-18]。而有害菌如丹毒絲菌科未知屬和顆粒鏈菌屬減少。

對于MHE組患者，顆粒鏈菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬和羅氏菌屬豐度減低，而韋榮球菌屬和巨球菌屬(均屬韋榮球菌科下級菌屬)則升高。而OHE組患者僅有韋榮球菌屬增多。顆粒鏈菌屬和羅氏菌屬是口腔和腸道菌群中的機(jī)會致病菌，腸球菌屬在肝硬化患者和HE患者中富集，與MELD評分有顯著的正相關(guān)性[8-9]。鏈球菌屬和韋榮球菌屬與腸道菌群失調(diào)以及較差的認(rèn)知水平相關(guān)[19-20]。Bajaj[9]報道了與健康人相比肝硬化HE患者韋榮球菌科相對豐度明顯更高。另外，既往文獻(xiàn)[21-23]發(fā)現(xiàn)韋榮球菌屬某些菌種參與了數(shù)種嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

因此本研究推測，雖然TIPS術(shù)建立了新的門體分流道，使部分腸源性毒素可以直接從門靜脈進(jìn)入體循環(huán)，但是術(shù)后門靜脈高壓得到緩解，腸道微循環(huán)和腸道環(huán)境發(fā)生改變，從而對腸道菌群產(chǎn)生了一定的影響。(1)原生菌群豐度升高而有害菌豐度降低，腸道微生態(tài)恢復(fù)，產(chǎn)生的腸源性毒素減少，MHE患者的腦病狀態(tài)得到改善；(2)有害菌/潛在致病菌有的增多有的減少，菌群狀態(tài)未得到明顯改善，隱性腦病狀態(tài)未緩解；(3)腦病富集菌韋榮球菌屬明顯增多，菌群失調(diào)加重，患者發(fā)生OHE。同時本研究發(fā)現(xiàn)糞球菌屬的變化量與術(shù)后腦病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。說明了原生菌群的增多對TIPS術(shù)后患者預(yù)后有更為重要的影響。

本研究存在一定的局限性。首先樣本量較小，需要大樣本多中心研究對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；第二，使用16S rRNA測序而不是宏基因組使研究不能深入到菌種水平進(jìn)行分析；第三，研究未考慮環(huán)境因素、飲食以及藥物使用如抗生素和質(zhì)子泵抑制劑等的影響；同時，TIPS術(shù)對腸道微環(huán)境具體產(chǎn)生了什么樣的作用，為什么會出現(xiàn)不同的腸道菌群改變，以及對于發(fā)生HE的患者，是菌群惡化造成腦病發(fā)生還是腦病發(fā)生導(dǎo)致菌群惡化仍需要進(jìn)一步研究。

總的來說，本研究報道了經(jīng)TIPS術(shù)后不同腦病狀態(tài)的MHE患者腸道菌群的變化情況，發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)狀態(tài)的改善情況與術(shù)后腦病狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)。其中原生菌群的升高相對有更重要的作用。這為預(yù)防和治療MHE患者術(shù)后腦病提供了微生物角度策略。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：韓國宏教授負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)；李萌浩、湯世豪、李凱、王鉦鈺、郭文剛和殷占新參與收集數(shù)據(jù)；李萌浩進(jìn)行資料分析和撰寫論文；李凱副主任醫(yī)師和韓國宏教授指導(dǎo)撰寫文章，修改論文并最后定稿。