林曉平， 余立華

海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 上海 200433

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史、肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。隨著肥胖癥的發(fā)病率逐年升高，NAFLD的發(fā)病率也不斷攀升。流行病學(xué)的數(shù)據(jù)[1]表明，約25%的美國(guó)人罹患NAFLD，其中30%進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，而約20%NASH患者最終會(huì)發(fā)展為肝硬化。近年來(lái)，我國(guó)的NAFLD患病率逐年增長(zhǎng)。一項(xiàng)meta分析[2]的結(jié)果表明，2000年至2006年我國(guó)大陸地區(qū)所報(bào)道的NAFLD患病率為18.22%(95%CI 14.32%～22.48%)，而2007至2009年所報(bào)道的NAFLD患病率為20.00% (95%CI 16.84～23.36)，2010至2013年患病率上升至20.68% (95%CI 17.28%～24.30%)。盡管目前仍缺少大陸地區(qū)NAFLD進(jìn)展為NASH甚至是肝硬化的確切百分比，但可以預(yù)見(jiàn)的是，未來(lái)30～50年內(nèi)由NAFLD導(dǎo)致的終末期肝病所帶來(lái)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)不容忽視。

目前針對(duì)NAFLD的治療，可選擇的藥物較少，如胰島素增敏劑、抗氧化劑、降脂藥和護(hù)肝藥等[3-4]，且多屬于對(duì)癥支持藥物，缺乏特異性藥物。近年來(lái)，研究者[5-8]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法(genome-wide association study, GWAS)確定肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity associated gene，F(xiàn)TO)是導(dǎo)致人類肥胖的候選基因。多項(xiàng)研究[5-6]結(jié)果表明，F(xiàn)TO基因的多態(tài)性位點(diǎn)與成人、兒童的體質(zhì)量指數(shù)、體質(zhì)量增長(zhǎng)、脂肪含量增加等相關(guān)。而在NAFLD患者的肝組織中FTO的表達(dá)量顯著增高[7]。然而FTO在肥胖癥及NAFLD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的作用機(jī)制并不確切。最近，有研究者[8]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO是RNA 的m6A去甲基化酶，植物提取物大黃酸(rhein)在體外可競(jìng)爭(zhēng)性地與FTO去甲基化酶活性位點(diǎn)結(jié)合，且對(duì)細(xì)胞內(nèi)的m6A去甲基化過(guò)程也有較好的抑制作用。

因此，本研究擬觀察rhein對(duì)高脂飲食導(dǎo)致的小鼠NAFLD的治療效果，旨在為NAFLD治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 Rhein購(gòu)自上海源葉生物，其純度為HPLC≥98%。高脂小鼠飼料購(gòu)自戴茨生物科技(無(wú)錫)有限公司。FTO抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。二抗為Rdye800標(biāo)記的羊抗兔IgG 和 IRdye700 標(biāo)記的羊抗鼠IgG (Li-Cor公司)。油紅染色試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 NAFLD小鼠模型及治療 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組：普飼組，高脂組，高脂+rhein組。根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，rhein用PBS配置成5 g/L混懸液，隔天固定時(shí)間120 mg·kg-1·d-1灌胃，非rhein組均予等量PBS灌胃。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 每周進(jìn)行小鼠稱重并記錄，并于實(shí)驗(yàn)開始后的第2周測(cè)量計(jì)算每組小鼠在3 d內(nèi)的攝食量，并連續(xù)測(cè)量21 d。第7周結(jié)束后，從眼眶靜脈取血，按常規(guī)制備血清標(biāo)本。常規(guī)方法處死小鼠后迅速取出肝臟，從肝右葉中部取肝組織2塊，其中一塊按常規(guī)制備肝組織冰凍切片標(biāo)本，另一塊用液氮進(jìn)行速凍后存入-80℃冰箱中用于Western印跡檢測(cè)。(1)生化分析：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。(2)油紅染色：取出預(yù)先制備好并保存在-20℃冰箱中的冰凍切片，放置在室溫回溫5～10 min；按照貯備液∶稀釋液=5∶2的比例配制染色液，并用濾紙慢速過(guò)濾備用；冰凍切片置入染色液中15 min，此后37℃蒸餾水中漂洗15 s；并復(fù)染5 min，水洗45 s；封片后即進(jìn)行鏡檢。(3)組織蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：采用Western印跡方法檢測(cè)組織中蛋白的表達(dá)水平。組織分組同上，使用RIPA裂解液裂解組織得到總蛋白，使用BCA法定量蛋白濃度，使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，并電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，使用脫脂奶粉溶液封閉過(guò)夜，次日加入相應(yīng)二抗孵育(帶熒光)后使用Odyssey (Li-Cor公司)進(jìn)行掃描，定量檢測(cè)FTO蛋白表達(dá)水平。選用β-actin作為定量的內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體質(zhì)量及攝食量的改變 自實(shí)驗(yàn)開始的第2周，連續(xù)21 d測(cè)定每組小鼠(10只)在3 d內(nèi)的攝食量。結(jié)果(圖1A)顯示，與普飼組比較，高脂組小鼠的攝食量明顯降低(P<0.01)， rhein灌胃后，小鼠攝食量并沒(méi)有明顯恢復(fù)。每周在相同時(shí)間點(diǎn)稱重小鼠體質(zhì)量。與高脂組比較，高脂+rhein組小鼠體質(zhì)量增加明顯減緩(圖1B)。在第7周，高脂+rhein組小鼠的體質(zhì)量明顯低于高脂組(P<0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組小鼠攝食量及體質(zhì)量的改變A：圖中的每一點(diǎn)代表10只小鼠在3 d內(nèi)的攝食量。自第2周開始，每3 d進(jìn)行一次測(cè)量，連續(xù)測(cè)量了21 d；B：每周在固定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量小鼠體質(zhì)量. Control： 普飼組； HFD： 高脂組； HFD+rhein： 高脂+rhein組. **P<0.01，*P<0.05

2.2 小鼠肝臟脂肪沉積的改變 在實(shí)驗(yàn)7周結(jié)束后，取各組小鼠的肝組織進(jìn)行H-E染色以確定肝臟組織中脂肪沉積情況。結(jié)果(圖2)顯示：在高脂組小鼠肝細(xì)胞中脂肪空泡明顯多于普飼組，表明非酒精性脂肪肝病造模成功。而與高脂組比較，高脂+rhein組小鼠肝細(xì)胞中脂肪空泡明顯減少，表明rhein有減少肝細(xì)胞脂肪沉積的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用油紅對(duì)肝細(xì)胞中的沉積脂肪進(jìn)行染色。高脂組小鼠肝細(xì)胞中脂肪沉積明顯多于普飼組，rhein灌胃的小鼠肝細(xì)胞中脂肪沉積明顯減少。

圖2 各組小鼠肝臟組織中脂肪沉積情況A：3組H-E染色和油紅染色結(jié)果. B：使用 Image J軟件對(duì)油紅染色照片中染色信號(hào)進(jìn)行定量分析(n=3). Control：普飼組；HFD：高脂組；HFD+rhien：高脂+rhien組

2.3 小鼠肝功能的改變 為進(jìn)一步驗(yàn)證rhein是否可以影響肝臟脂質(zhì)代謝及肝功能，在實(shí)驗(yàn)7周結(jié)束后，留取各組小鼠的血清，并測(cè)量ALT、AST、LDL和HDL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示，在高脂組小鼠中肝功能明顯受損，而采用rhein灌胃后，小鼠的肝功能有明顯恢復(fù)(圖3A、3B)。LDL和HDL測(cè)量的結(jié)果(圖3C、3D)顯示，與普飼組的小鼠比較，高脂組小鼠脂肪代謝明顯紊亂。

圖3 各組小鼠血清中ALT、AST、LDL和HDL濃度改變Control： 普飼組; HFD: 高脂組; HFD+rhein: 高脂+rhein組. **P<0.01，*P<0.05

2.4 小鼠肝臟組織中FTO表達(dá)量的改變 結(jié)果(圖4)顯示，F(xiàn)TO蛋白在高脂組小鼠的肝組織中顯著增多，而在高脂+rhein組小鼠肝組織中FTO蛋白的表達(dá)量明顯回落。

圖4 Western blot檢測(cè)各組小鼠肝組織中FTO蛋白表達(dá)量 Control: 普飼組; HFD: 高脂組; HFD+rhein: 高脂+rhein組

3 討 論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活方式變遷，肥胖癥、高血壓、糖尿病、NAFLD等慢性疾病對(duì)人類健康的危害越來(lái)越引起重視。NAFLD如得不到有效控制，相當(dāng)大比例的患者會(huì)進(jìn)展為NASH，甚至是肝硬化。已有研究[9-10]表明，NAFLD具有一定的遺傳易感性，多個(gè)GWAS研究結(jié)果[11-12]顯示，SNP位點(diǎn)可增加NAFLD的患病風(fēng)險(xiǎn)。更重要的是，飲食結(jié)構(gòu)改變、運(yùn)動(dòng)量減少等環(huán)境因素是導(dǎo)致NAFLD發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素。

然而，目前針對(duì)NAFLD治療的方案多半不具有特異性，以對(duì)癥支持治療為主，如降脂、抗炎、抗氧化等。一方面，治療的效果有待商榷；另一方面，這些治療措施可能會(huì)帶來(lái)其他不良反應(yīng)。之所以缺少特效藥，是因?yàn)槟壳叭藗儗?duì)NAFLD的進(jìn)展機(jī)制及干預(yù)的靶點(diǎn)并不清楚。20余年前人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FTO基因的多態(tài)性與肥胖癥相關(guān)。近年來(lái)，研究者[8]發(fā)現(xiàn)FTO可作為RNA m6A 去甲基化酶而發(fā)揮著重要作用。特別是多項(xiàng)研究[13-14]表明，F(xiàn)TO的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。眾所周知，NAFLD可能會(huì)進(jìn)展為NASH，從而啟動(dòng)肝臟的慢性炎癥過(guò)程，激活肝臟組織中的星狀細(xì)胞，促進(jìn)纖維化過(guò)程，最終導(dǎo)致肝硬化、原發(fā)性肝細(xì)胞癌。已有文獻(xiàn)[7]稱，F(xiàn)TO在NAFLD患者的肝組織明顯上調(diào)表達(dá)，表明FTO可能是阻斷該病進(jìn)展的干預(yù)靶點(diǎn)。

Rhein中文名大黃酸，是植物提取物。一直以來(lái)作為減肥藥、抗炎藥、抗腫瘤藥而被廣泛探討。也有研究[15-16]表明，rhein可改善高脂飲食所導(dǎo)致的大鼠NAFLD。本研究結(jié)果也表明，rhein可以減少NAFLD過(guò)程中肝細(xì)胞中脂肪沉積，促進(jìn)肝功能恢復(fù)，具有明確的NAFLD治療效果。然而，rhein作用的靶點(diǎn)并不明確。近期研究[8]表明，rhein在體外可競(jìng)爭(zhēng)性地與FTO去甲基化酶活性位點(diǎn)結(jié)合，并且抑制其去甲基化酶的作用，這一發(fā)現(xiàn)為rhein作用靶點(diǎn)的確定提供了機(jī)會(huì)。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD會(huì)導(dǎo)致肝組織中FTO蛋白表達(dá)上調(diào)，而在rhein的作用下FTO蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，這些結(jié)果表明，rhein可能通過(guò)減少FTO蛋白的表達(dá)而改善NAFLD患者肝臟組中脂肪沉積以及肝功能損害。可見(jiàn)，rhein可作為NAFLD治療的藥物。

本研究也存在一定的局限性：首先，本研究?jī)H僅是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)rhein的有效劑量范圍，可能存在的不良反應(yīng)，在人類NAFLD治療中是否有效等問(wèn)題，目前仍然沒(méi)有解決，還需要更進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。第二，本研究發(fā)現(xiàn)rhein可減少NAFLD小鼠肝組織中FTO蛋白表達(dá)量，但其機(jī)制并不清楚。更重要的是，除了FTO可能是rhein作用的靶點(diǎn)，rhein在NAFLD治療中其他的作用靶點(diǎn)也不明確。