解雙瑜，孫 波,*，劉 麗，李天一，叢 霞

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省藥品檢驗(yàn)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150001）

東北農(nóng)家醬作為中國(guó)北方歷史悠久的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品因其獨(dú)特的風(fēng)味深受人們的喜愛(ài)。其中食鹽雖為發(fā)酵輔料但卻起著不可或缺的重要作用，對(duì)產(chǎn)品的感官風(fēng)味、貨架期甚至食品安全性都有非常重要的影響[1-2]。在其發(fā)酵過(guò)程中食鹽添加量一般控制在12%左右甚至更高，這主要是因?yàn)楦吆康氖雏}可以有效地抑制不良微生物的增殖與代謝。然而，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的研究都表明人類日常飲食中長(zhǎng)期過(guò)量攝入食鹽會(huì)導(dǎo)致高血壓、心腦血管等疾病[3-4]的發(fā)生。世界衛(wèi)生組織則建議，每人每天食鹽攝入量應(yīng)不高于5 g[5]。我國(guó)從2018年起也首次推出了《中國(guó)食品工業(yè)減鹽指南》，為食品加工提供減鹽技術(shù)指導(dǎo)建議、路線和措施?？傊?，減鹽已成為世界各國(guó)未來(lái)食品工業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)之一[6]。東北農(nóng)家醬作為高鹽食品，采取減鹽措施也勢(shì)在必行，但是進(jìn)行減鹽處理很有可能導(dǎo)致其發(fā)酵過(guò)程中微生物菌系發(fā)生變化[7-8]，以及如生物胺等一些不良代謝產(chǎn)物的形成與過(guò)量積累[9-13]。

生物胺是一類具有生物活性的含氮有機(jī)小分子化合物[14]，其中最常見(jiàn)的生物胺包括精胺、腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺等。雖然人類機(jī)體在正常生理代謝活動(dòng)中需要一定量的生物胺[15-16]，但是生物胺過(guò)量積累會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性[17-19]，其中以組胺的毒性最強(qiáng)[20-21]。生物胺在大豆發(fā)酵制品[22-24]、腌制魚(yú)以及肉制品[25]等發(fā)酵食品中[26-28]廣泛存在，是影響其食品安全性的重要因素之一。目前世界各國(guó)關(guān)于食品中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)均不同。其中歐盟委員會(huì)建議食品中組胺含量不應(yīng)超過(guò)100 mg/kg[29]。綜上所述，有關(guān)食鹽對(duì)東北農(nóng)家醬中生物胺形成影響的研究工作意義重大。

基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同食鹽添加量對(duì)東北農(nóng)家醬中生物胺含量、理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)以及感官品質(zhì)的影響，以期在控制生物胺代謝過(guò)量積累的前提下盡可能減少食鹽添加量，并最終為減鹽東北農(nóng)家醬的生產(chǎn)提供一定的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽、色胺、β-苯乙胺、尸胺鹽酸鹽、組胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、亞精胺、1,7-二氨基庚烷 上海世峰生物科技有限公司；丹磺酰氯美國(guó)Sigma公司；超純水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；乙腈、丙酮、乙酸銨、乙酸均為色譜純；碳酸氫鈉、氨水、氫氧化鈉、甲醛均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀（配有SPD-20A紫外檢測(cè)器、Lab Solution工作站） 日本島津公司；LG10-2.4A高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FA2004分析天平上海衡平儀器儀表廠；DH2500A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3E總酸計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.3 方法

1.3.1 減鹽東北農(nóng)家醬的樣品制備與采集

1.3.1.1 東北農(nóng)家醬的生產(chǎn)工藝流程

大豆→除雜→浸泡→蒸豆→卡塊→制曲→曲塊入醬缸→加鹽水→發(fā)酵→打耙、曬醬→灌裝、封袋→成品

1.3.1.2 減鹽東北農(nóng)家醬樣品制備

將經(jīng)過(guò)篩選的大豆原料進(jìn)行除雜后稱量，再投入泡豆槽中用清水浸泡約10 h直至豆粒慢慢吸收水分呈無(wú)夾心狀態(tài)。將已浸泡好的大豆放入旋轉(zhuǎn)蒸鍋采用加壓蒸煮方式進(jìn)行蒸豆（蒸汽壓0.15 MPa、時(shí)間15 min）。蒸豆結(jié)束后將其經(jīng)輸送機(jī)連續(xù)輸送至卡塊機(jī)，制成40 cm×20 cm×10 cm曲塊并移入曲房進(jìn)行制曲，制曲時(shí)間為60 d。當(dāng)曲塊完全成熟后按照曲塊、食鹽、水質(zhì)量比3∶1∶10投料到150 kg的醬缸中作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)另取4 個(gè)150 kg的醬缸，加入與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組等量的曲塊和水，僅在對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的基礎(chǔ)上將食鹽添加量分別減少10%、20%、30%、40%，依次作為減鹽實(shí)驗(yàn)組1、減鹽實(shí)驗(yàn)組2、減鹽實(shí)驗(yàn)組3、減鹽實(shí)驗(yàn)組4，上述5 組均在同一條件下進(jìn)行發(fā)酵，期間充分打耙混合均勻，90 d后發(fā)酵結(jié)束。

1.3.1.3 減鹽東北農(nóng)家醬的樣品采集

從上述5 組東北農(nóng)家醬中分別稱取200 g樣品用于生物胺含量、理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)測(cè)定及感官品質(zhì)評(píng)分。

1.3.2 東北農(nóng)家醬樣品中生物胺含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品（生物胺標(biāo)準(zhǔn)品稱取量分別為：精胺鹽酸鹽17.6 mg、腐胺鹽酸鹽18.7 mg、色胺10.2 mg、β-苯乙胺10.2 mg、尸胺鹽酸鹽17.5 mg、組胺鹽酸鹽16.9 mg、酪胺鹽酸鹽12.9 mg、亞精胺10.3 mg），用0.1 mol/L HCl溶液配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分別取上述溶液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，充分混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取東北農(nóng)家醬10.0 g，加入500 μL 1,7-二氨基庚烷（1.0 mg/mL），混合均勻。加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的三氯乙酸溶液，混勻，振蕩提取30 min，隨后6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中，殘?jiān)?0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液定容至刻度。

1.3.2.4 試樣衍生化處理

分別吸取1 mL待衍生的樣品溶液和系列生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入200 μL氫氧化鈉溶液（2 mol/L）、3 0 0 μ L 飽和碳酸氫鈉溶液、2 m L 丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為丙酮），漩渦混勻1 min后置于40 ℃恒溫水浴中衍生45 min，取出，分別加入100 μL的氨水（體積分?jǐn)?shù)25%），于避光處反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾到進(jìn)樣小瓶，待測(cè)定[30]。

1.3.2.5 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL，梯度洗脫條件參考GB 5009.208—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》。

1.3.3 東北農(nóng)家醬理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 東北農(nóng)家醬中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

參考GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中第一法——酸度計(jì)法測(cè)定東北農(nóng)家醬中氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.3.2 東北農(nóng)家醬中總酸含量的測(cè)定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定東北農(nóng)家醬中總酸含量。

1.3.4 東北農(nóng)家醬中微生物指標(biāo)的測(cè)定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定東北農(nóng)家醬中菌落總數(shù)。

1.3.5 東北農(nóng)家醬感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

挑選10 名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后的品評(píng)人員，對(duì)不同東北農(nóng)家醬樣品進(jìn)行滋味、氣味、色澤和體態(tài)的品評(píng)。具體操作方法如下：稱取50 g樣品，置于白色瓷盤中，觀察其氣味、色澤、體態(tài)，并用玻璃棒蘸取，嘗其滋味。每品嘗完一個(gè)樣品后，用清水漱口，再進(jìn)行下一個(gè)樣品的品嘗，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 東北農(nóng)家醬感官品質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of farmhouse fermented soybean paste in northeast China

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，圖表采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬生物胺形成的影響

2.1.1 生物胺圖譜與標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1.1 生物胺圖譜

圖1 8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生物混合色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed derivatives of 8 biogenic amine standards

從圖1可以看出，整個(gè)梯度洗脫結(jié)束時(shí)間為37 min，在該時(shí)間內(nèi)所有生物胺衍生物被全部洗脫出，且各生物胺衍生物分離效果好，峰形對(duì)稱，無(wú)雜質(zhì)干擾，表明該流動(dòng)相梯度是可行的。8 種單一生物胺衍生物分析結(jié)束后，確定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液8 種生物胺衍生物的出峰順序?yàn)椋壕?、腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺。

2.1.1.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，以8 種生物胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示，8 種生物胺在1～100 mg/L范圍內(nèi)線性良好，決定系數(shù)R2≥0.999，可以滿足生物胺測(cè)定的要求。

表2 8 種生物胺的保留時(shí)間、回歸方程和決定系數(shù)Table 2 Retention times, calibration equations and coefficient of determination of 8 biogenic amines

2.1.2 減鹽東北農(nóng)家醬中生物胺含量變化

如圖2所示，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的總胺及精胺、腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺含量分別為253.84、92.71、7.09、8.84、19.04、36.90、47.04、40.91、1.31 mg/kg。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比，減鹽實(shí)驗(yàn)組1中腐胺含量增加至13.93 mg/kg，總胺及其他種類胺含量無(wú)明顯變化；減鹽實(shí)驗(yàn)組2中總胺及苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺含量分別增加至341.64、30.12、68.59、64.32、47.98 mg/kg，其他種類胺含量無(wú)明顯變化；減鹽實(shí)驗(yàn)組3及減鹽實(shí)驗(yàn)組4中總胺及腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺含量均有所增加，其中，總胺含量分別增加至382.31、419.68 mg/kg，腐胺含量分別增加至15.54、15.73 mg/kg，色胺含量分別增加至11.76、11.94 mg/kg，苯乙胺含量分別增加至29.13、28.46 mg/kg，尸胺含量分別增加至74.20、111.57 mg/kg，組胺含量分別增加至103.46、107.42 mg/kg，酪胺含量分別增加至51.05、48.51 mg/kg，其他種類胺含量無(wú)明顯變化。

2.2 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬理化指標(biāo)的影響

圖2 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬生物胺形成的影響Fig.2 Effect of salt reduction on biogenic amine formation in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

如圖3、4所示，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮、總酸含量分別為1.03、1.37 g/100 g。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比，減鹽實(shí)驗(yàn)組1中氨基酸態(tài)氮與總酸含量均無(wú)明顯變化；減鹽實(shí)驗(yàn)組2、減鹽實(shí)驗(yàn)組3、減鹽實(shí)驗(yàn)組4中，總酸含量均有所增加，分別增加至1.85、2.01、2.34 g/100 g，氨基酸態(tài)氮含量無(wú)明顯變化。

圖3 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of salt reduction on amino nitrogen content in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

圖4 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬總酸含量的影響Fig.4 Effect of salt reduction on acidity in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

2.3 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬微生物指標(biāo)的影響

圖5 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effect of salt reduction on total number of colonies in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

如圖5 所示， 對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的菌落總數(shù)為7.6（lg（CFU/g））。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比，減鹽實(shí)驗(yàn)組1、減鹽實(shí)驗(yàn)組2中菌落總數(shù)均無(wú)明顯變化；減鹽實(shí)驗(yàn)組3、減鹽實(shí)驗(yàn)組4中菌落總數(shù)有所增加，分別增加至9.2、9.4（lg（CFU/g））。

2.4 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬感官品質(zhì)的影響

圖6 減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬感官品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of salt reduction on sensory evaluation score of farmhouse fermented soybean paste in northeast China

如圖6所示，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的滋味、氣味、色澤、體態(tài)評(píng)分及總分分別為32.6、28.3、18.6、9.3、88.8 分。與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比，減鹽實(shí)驗(yàn)組1中滋味、氣味、色澤、體態(tài)評(píng)分及總分均無(wú)明顯變化，減鹽實(shí)驗(yàn)組2中滋味評(píng)分及總分有所升高，其中滋味評(píng)分升高至36.3 分，總分升高至92.6 分，氣味、色澤、體態(tài)評(píng)分無(wú)明顯變化；減鹽實(shí)驗(yàn)組3中，滋味、氣味評(píng)分及總分有所降低，其中滋味評(píng)分降低至30.7 分，氣味評(píng)分降低至26.7 分，總分降低至85.6 分；減鹽實(shí)驗(yàn)組4中，滋味、氣味評(píng)分及總分有所降低，其中滋味評(píng)分降低至28.5 分，氣味評(píng)分降低至24.5 分，總分降低至80.0 分。

3 結(jié) 論

與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比，減鹽實(shí)驗(yàn)組隨著食鹽添加量的減少除精胺與亞精胺外，其總胺與其他生物胺的含量均有不同程度的增加，且尸胺與組胺含量的增加最為明顯。同時(shí)總酸含量、菌落總數(shù)及感官品質(zhì)評(píng)分均有不同程度的變化；而氨基酸態(tài)氮含量則無(wú)明顯變化。

總之，減鹽對(duì)東北農(nóng)家醬中生物胺形成以及理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)和感官品質(zhì)均有一定程度的影響。其中，食鹽添加量減少20%以下的減鹽實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比其組胺含量并無(wú)明顯增加，其組胺含量低于歐盟委員會(huì)的建議限量（100 mg/kg）。此外，食鹽添加量減少20%以下的減鹽實(shí)驗(yàn)組其東北農(nóng)家醬理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)也無(wú)明顯變化，感官品質(zhì)評(píng)分有所增加。因此，綜合考慮減鹽東北農(nóng)家醬生產(chǎn)時(shí)其食鹽添加量在正常食鹽添加量的基礎(chǔ)上減少20%左右時(shí)比較適宜。