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        QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性產(chǎn)品中9種β-受體激動(dòng)劑殘留

        2021-03-02 11:02:46萬偉杰王冬根周瑤敏
        關(guān)鍵詞:激動(dòng)劑甲酸乙腈

        肖 勇,萬偉杰,鄔 磊,王冬根,周瑤敏,徐 俊

        (江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(南昌)/江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330200)

        β-受體激動(dòng)劑,俗稱瘦肉精,是具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)的腎上腺素類的合成藥物[1]。在臨床醫(yī)學(xué)上,將其作為平喘性藥物,用于治療支氣管哮喘的相關(guān)疾病[2]。以前,β-受體激動(dòng)劑在畜牧生產(chǎn)中被廣泛用作生長促進(jìn)劑,因?yàn)樗梢蕴岣呱i的瘦肉率,減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本[3]。但研究發(fā)現(xiàn)[4-5],β-受體激動(dòng)劑化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在動(dòng)物組織中很難被分解,可通過食物鏈逐漸在人體內(nèi)積累,若消費(fèi)者長期食用這類食品,將可能會引起慢性或急性中毒,以及心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的病變,甚至可能誘發(fā)惡性腫瘤,因此中國和歐盟等許多國家均嚴(yán)厲禁止該類藥物用于畜禽生產(chǎn)。其實(shí)早在2002 年,我國就將β-受體激動(dòng)劑列入《食用動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》[6]。近幾年風(fēng)險(xiǎn)評估調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn),在利益的驅(qū)使下,違法使用β-受體激動(dòng)劑的現(xiàn)象依然嚴(yán)峻,尤其是鹽酸克倫特羅的違禁使用[7]。

        目前,β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留的檢測方法主要有液相色譜法[8-9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等。液相色譜法僅靠保留時(shí)間定性,針對復(fù)雜樣品的抗干擾能力差、靈敏度等均不能滿足當(dāng)前殘留檢測的要求;氣質(zhì)聯(lián)用法的前處理步驟需衍生,操作繁瑣、耗時(shí)較長;而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、特異性強(qiáng),并且可同時(shí)檢測多種目標(biāo)化合物,因此是現(xiàn)階段最主要的檢測技術(shù)手段。在前處理方面,常見的凈化方法分為2種:一種是固相萃取法,另一種是QuEChERS法。在固相萃取的方法中,文獻(xiàn)報(bào)道較多的是用PCX柱[13]、HLB柱[14]和混合型MCX柱[15]對樣品進(jìn)行凈化,現(xiàn)行主流適用于動(dòng)物源性β-受體激動(dòng)劑檢測的3種國標(biāo)方法[16-18]、凈化方式采用的也是固相萃取。固相萃取方法雖然凈化效果好,但前處理過程繁瑣、耗時(shí)長、效率低,不適宜用于大批量樣品的檢測。自2003年QuEChERS凈化方法[19]首次發(fā)布以來,很多報(bào)道聚焦在農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留樣品處理方面,而對獸藥殘留檢測方面報(bào)道則相對較少。

        本文參照《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所自建方法)[20],利用QuEChERS凈化方式,聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時(shí)分析牛肉中9種β-受體激動(dòng)劑的測定方法,優(yōu)化了流動(dòng)相、提取溶劑、定溶液和稀釋倍數(shù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié),所建立的方法簡便、快速、靈敏、實(shí)用,為動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的監(jiān)測提供了又一個(gè)快速、有效的方法,有利于提升對β-受體激動(dòng)劑的監(jiān)控水平,適用于在檢測機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展大批量樣品檢測。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        儀器:Agilent 6460-1295超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司),945605渦旋混合器(美國TALBOYS公司),LXJ-IIB高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),YP5102電子天平(上海光正),S210 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器公司),THZ-92B回旋式振蕩儀(上海博迅),Milli-Q超純水儀(默克公司),SHZ-B恒溫水浴鍋(常州金壇友聯(lián)),N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)。

        試劑:特布他林標(biāo)準(zhǔn)品、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、沙丁胺醇-D標(biāo)準(zhǔn)品、克倫特羅-D9標(biāo)準(zhǔn)品(均為德國Dr.Ehrenstorfer公司提供);西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品、非諾特羅標(biāo)準(zhǔn)品、氯丙那林標(biāo)準(zhǔn)品、妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品、噴布特羅標(biāo)準(zhǔn)品(均為德國WITEGA公司提供);P-QuEChERS-AOAC 1202提取鹽包:內(nèi)含6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉(阿爾塔科技有限公司);F-QuEChERS-AOAC 3202多功能針式過濾器:內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA(阿爾塔科技有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:分別取上述9種β-受體激動(dòng)劑和2種同位素內(nèi)標(biāo)對照品適量,精密稱取,用甲醇溶解,制得100 μg/mL β-受體激動(dòng)劑的儲備液,于-20 ℃下避光儲存。

        標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制:分別移取適量9種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;移取適量2種同位素內(nèi)標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液,均在-20 ℃下避光儲存。

        標(biāo)準(zhǔn)工作液:取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.20 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成0.20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液;移取0.50 mL的2種同位素內(nèi)標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋成0.50 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液,均在-20 ℃下避光儲存。

        1.2.2 液相色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱溫40 ℃;流動(dòng)相:A相0.1%甲酸水溶液,B相甲醇溶液;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量10.00 μL;梯度洗脫步驟:0~0.50 min,維持2% B;0.50~4.00 min,2% B~35% B;4~5 min,35% B~80% B;5.00~5.50 min,80% B~90% B;5.5~5.7 min,90% B~2% B;5.7~9.0 min維持2% B。

        1.2.3 質(zhì)譜參數(shù) 離子源:電噴霧;掃描方式:正離子;電離電壓:4.0 kV;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測;源溫:325 ℃;干燥氣流速:5 L/min;霧化氣壓力:50 psi;鞘流氣溫度:350 ℃;鞘流氣流速:12 L/min。優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測試驗(yàn)條件見表1。

        表1 9種β-受體激動(dòng)劑和2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

        1.3 樣品的處理

        稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入0.02 mL 0.50 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液、10 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液(pH=5.2)、0.04 mL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,渦旋混勻,振蕩10 min,于37 ℃下避光水浴酶解16 h,酶解后放置至室溫,加入10 mL 2%甲酸-乙腈溶液,再加入P-QuEChERS-AOAC提取鹽包,渦旋振蕩1 min,4500 r/min離心5 min,將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,在離心管中加入5 mL乙腈飽和的正己烷,渦旋混合30 s,4500 r/min離心1 min。吸取下清液以逐滴流出的速度勻速通過多功能針式過濾器至15 mL離心管中,準(zhǔn)確吸取5 mL濾液,于50 ℃氮吹至近干,先加0.25 mL乙腈復(fù)溶,渦旋30 s,再加入0.75 mL 0.1%甲酸水溶液,混勻,過0.22 μm的濾膜,上機(jī)待測。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 前處理方法的優(yōu)化

        2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化 β-受體激動(dòng)劑是在苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核的基礎(chǔ)上進(jìn)行官能團(tuán)修飾和改造后形成的一大類化合物,屬于水溶性強(qiáng)和極性多樣的化合物群。通過查閱文獻(xiàn)[21-22],多種獸藥殘留分析中一般采用乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑作為提取試劑,甲醇、乙腈都可以降低高脂肪、高蛋白的基質(zhì)干擾,但與甲醇相比,乙腈提取時(shí)帶入的極性干擾物更少,有利于后續(xù)凈化。本研究采用空白加標(biāo)(2.0 μg/kg)的方式比較了1%甲酸-乙腈[23]、2%甲酸-乙腈[24]、5%甲酸-乙腈[25]、0.1%乙酸乙腈[20]、2%乙酸乙腈、5%氨水乙腈[26]、80%乙腈-水[27]、純乙腈等8種溶劑提取,定溶液選擇0.1%甲酸水∶甲醇=9∶1。結(jié)果表明:在提取溶劑乙腈中加入適當(dāng)?shù)乃岷螅?種化合物的回收率普遍較高,其可能原因是β-受體激動(dòng)劑一般是弱堿性化合物[24],在酸性溶液中呈現(xiàn)離子狀態(tài)有利于提??;在酸性條件下,西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林和克倫特羅均有較理想的回收率(>80%),但萊克多巴胺只有在2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈的提取條件下能實(shí)現(xiàn)優(yōu)于其他提取劑的回收,另外特布他林在5%甲酸-乙腈的提取條件下的回收率明顯低于2%甲酸-乙腈,故試驗(yàn)選擇2%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑(圖1)。

        圖1 不同提取溶劑的回收率比較

        2.1.2 定溶液的選擇 樣品上機(jī)前復(fù)溶液的確定直接影響方法的靈敏度,本文比較了定溶液中不同有機(jī)相比例后發(fā)現(xiàn),在定溶液中加入一定比例的有機(jī)相可明顯提高對噴布特羅的響應(yīng)[28],可有效地提高其回收率。但使用有機(jī)相比例過大時(shí),如在使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1[19]時(shí)發(fā)現(xiàn),西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅和特布他林的出峰均出現(xiàn)分叉的情況,峰型較差,結(jié)果如圖2所示。

        圖2 使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1作為定溶液峰型分叉效果圖

        最后,本試驗(yàn)比較了文獻(xiàn)報(bào)道中常見的5種定溶液組合的回收率,定溶液分別為v0.1%甲酸水∶v甲醇=9∶1[29]、0.1%甲酸水[14,24,30]、350 μL甲醇+650 μL 0.1%甲酸水[23]、250 μL乙腈+750 μL 0.1%甲酸水、v0.1%甲酸水∶v乙腈=9∶1[24],結(jié)果如圖3所示。定溶液中水相與有機(jī)的比例對極性敏感物質(zhì)有一定的影響,本試驗(yàn)先用250 μL乙腈對氮吹干后的物質(zhì)進(jìn)行渦旋復(fù)溶,然后再加750 μL 0.1%甲酸水混勻,如此操作下各種化合物的峰型和回收率均達(dá)到滿意的效果。

        圖3 5種定溶液試驗(yàn)所得各種化合物的回收率

        2.1.3 流動(dòng)相選擇 基于β-受體激動(dòng)劑類藥物均具有較強(qiáng)的水溶性,而且本研究中的9種化合物既有極性(如沙丁胺醇),也有弱極性(如克倫特羅、妥布特羅),還有非極性(如噴布特羅)等,所以需要選擇合適的流動(dòng)相才能將各種物質(zhì)在不同的時(shí)間被洗脫下來,從而達(dá)到有效分離的目的。有文獻(xiàn)表明,在正離子掃描的模式下,流動(dòng)相加入一定量的甲酸可以提高離子化效率和分離度[31-32],故本文比較了甲醇、乙腈作為有機(jī)相分別與0.1%甲酸溶液組成流動(dòng)相的效果。結(jié)果表明:將甲醇作為有機(jī)相時(shí),各種化合物響應(yīng)值較高;而當(dāng)甲醇中加入0.1%甲酸后,對待測物響應(yīng)強(qiáng)度的影響不大,因此本研究選擇0.1%甲酸水-甲醇溶液作為流動(dòng)相。在該流動(dòng)相體系下,所有化合物的峰型尖銳,相互無干擾,并且可以在7 min內(nèi)完成目標(biāo)物的分離和色譜柱的分離。各種目標(biāo)化合物的選擇離子流色譜圖見圖4。

        圖4 各種目標(biāo)化合物的選擇離子流色譜圖

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量限

        本方法通過使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對9種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行分析,以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度作為橫坐標(biāo),各種藥物定量離子對峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。β-受體激動(dòng)劑在0.25~10.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,各種藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。試驗(yàn)采用在空白牛肉中添加目標(biāo)組分的方法,依據(jù)定性或定量離子對色譜峰的信噪比大于10為定量限,得出各種藥物的定量限為0.25 μg/kg。

        表2 牛肉中9種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.3 精密度與回收率試驗(yàn)

        取0.25、0.50、2.50 μg/kg共3個(gè)梯度水平的陽性添加試樣,按照“1.3樣品的處理”的步驟操作,每個(gè)濃度進(jìn)行5個(gè)平行試驗(yàn),以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,%)計(jì)算精密度,以實(shí)測濃度與理論添加濃度之比,計(jì)算各個(gè)被測物質(zhì)的方法回收率,結(jié)果在低(0.25 μg/kg)、中(0.50 μg/kg)、高(2.50 μg/kg)濃度下,β-受體激動(dòng)劑的精密度小于10%,回收率在67.73%~114.13%之間,具體結(jié)果見表3。

        表3 β-受體激動(dòng)劑的精密度和回收率(n=5)

        2.4 實(shí)際樣品的分析

        對日常檢測任務(wù)中收集的4份陽性牛肉樣品(T1、T2、T3、T4),分別選用本方法、國標(biāo)GB/T 21313—2007和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-18—2008中的方法進(jìn)行了測試,樣品中均檢出有克倫特羅,結(jié)果見表4。說明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對牛肉中β-受體激動(dòng)劑的殘留檢測。

        表4 實(shí)際樣品分析結(jié)果 μg/kg

        3 結(jié)論

        本研究以2%甲酸-乙腈溶液作為提取劑,采用QuEChERS前處理技術(shù),結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜參數(shù),建立了快速測定牛肉中9種常見β-受體激動(dòng)劑殘留的方法,大大簡化了前處理過程;結(jié)合新型凈化方法,降低了基質(zhì)對分析物的干擾,提高了樣品的檢測效率,使得檢測更加準(zhǔn)確、可靠,為今后畜產(chǎn)品中受體激動(dòng)劑的殘留檢測提供了一種新的方法。

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