李小玲,王 妍,華智銳
(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000)
黃芩(Sctellariabaicalensis)屬唇形科(Lamiaceae)黃芩屬(Scutellaria)多年生草本藥用植物,根可入藥,有止血安胎和清熱解毒等功效。近年研究表明,黃芩兼有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫力以及抑制艾滋病毒HIV22RT的作用[1]。黃芩是我國常用的大宗中藥材[2],在我國主要分布于山東、山西、陜西、甘肅四大產(chǎn)區(qū),具有較強的耐寒、耐旱、耐鹽堿特性且主要在旱地栽培。
土壤鹽漬化是全球性問題,全世界鹽堿地約占全球總面積的1/4,世界上遭受著鹽堿侵害的國家高達(dá)100多個。我國鹽堿地分布廣泛,主要在沿海地區(qū)及西北地區(qū)[3]。由于生態(tài)環(huán)境不斷惡化,近年來土壤鹽漬化面積逐年增加,且通常為復(fù)合鹽堿地,即鹽化和堿化相伴存在[4,5]。在輕度鹽堿脅迫的土地中有些作物的生長發(fā)育會受到抑制,產(chǎn)量有所下降;而除少數(shù)草類外,多數(shù)農(nóng)作物在重度鹽堿脅迫土地上均不能生長,可見作物產(chǎn)量的形成受到了鹽堿脅迫的嚴(yán)重制約[6]。
研究表明,自然界中鹽堿地會傷害植物組織,過多鹽積累會導(dǎo)致植物代謝紊亂,引起植物生理干旱,進(jìn)而影響植物的營養(yǎng)狀況[7,8]。對于大多數(shù)植物來說,高濃度的鹽堿環(huán)境會導(dǎo)致植物生長不良[9],尤其鹽堿和干旱環(huán)境對植物的影響最大,特別是鹽堿脅迫會造成70%的農(nóng)作物產(chǎn)量下降[10]。韓亞琦等[11]研究發(fā)現(xiàn),榭櫟在鹽環(huán)境下其生長指標(biāo)會受到顯著抑制;盛彥敏等[12]研究發(fā)現(xiàn),在不同程度的鹽堿環(huán)境中向日葵的根系活力、葉面積等指標(biāo)都會下降,并且隨著鹽濃度的升高鹽脅迫作用增強;潘羿壅[13]對巨菌草的研究表明,高濃度的鹽堿脅迫會使其各項生理指標(biāo)發(fā)生顯著變化;土壤鹽漬化已成為影響全球可利用耕地、作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要非生物因子之一[14-15]。關(guān)于耐鹽植物如何適應(yīng)鹽堿環(huán)境已成為國內(nèi)外專家學(xué)者們研究的熱點問題。
近年來,由于受自然條件及氣候差異的影響,土壤鹽漬化現(xiàn)象日益突出,黃芩的生長環(huán)境已受到非生物因子的嚴(yán)重影響,導(dǎo)致其生物學(xué)和藥學(xué)品質(zhì)受到嚴(yán)重侵害,限制了黃芩產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前,國內(nèi)外有關(guān)鹽害或堿害對植物的影響研究主要集中在單一鹽或單一堿上,而對于混合鹽堿脅迫研究較少,且集中在糧食作物、牧草、蔬菜及果樹等方面[16-18],鑒于此,本試驗以黃芩為材料,開展了混合鹽堿脅迫對黃芩生理特征的影響研究,旨在為鹽堿地區(qū)黃芩的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培以及逆境生理機制和抗性育種研究提供科學(xué)依據(jù)。
供試一年生黃芩幼苗于2019年4月購自商洛市商山中藥材種植基地;NaCl、Na2SO4、NaHCO3和Na2CO3為分析純試劑(含量≥99.5%),購自陜西晶博生物科技有限公司。
將一年生黃芩幼苗移栽至直徑10 cm×高度15 cm的塑料花盆中進(jìn)行培養(yǎng),在緩苗期間定時澆水和松土使土壤保持濕潤,以恢復(fù)至正常生理狀態(tài),澆水量視降雨情況而定,且各處理澆水量一致。每盆3~5株,每個處理3盆;1周后隨機選取各處理的幼苗用于試驗。
根據(jù)自然環(huán)境中主要鹽堿成分組成的特點,本試驗選擇中性鹽NaCl、Na2SO4和堿性鹽Na2CO3、NaHCO3,分別按不同的比例混合,分成4組:A、B、C、D(表1)。將各組組內(nèi)設(shè)置4個鹽濃度梯度:50、100、150、200 mmol/L,且每個處理組采用相同測定的pH值,以蒸餾水處理為對照(CK)[19]。各溶液的pH值采用雷磁PHS-3E型pH計進(jìn)行測定。
表1 各處理組NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3配比及pH值
采用灌根的方式每兩天對黃芩幼苗澆灌一次,每次灌根于19:00~21:00進(jìn)行,澆灌500 mL相應(yīng)的鹽堿混合處理液,確保處理液完全加入且不溢出[20]。每種處理重復(fù)3次,每次重復(fù)3株苗。處理1周后采集各處理黃芩幼苗的第3~4片功能葉進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。
丙二醛(MDA)和葉綠素含量的測定參照張志良等[21]的硫代巴比妥酸(TBA)檢測法和丙酮-碳酸鈣法;過氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參照李合生[22]的愈創(chuàng)木酚法和氮藍(lán)四唑法;參照高俊風(fēng)[23]的紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性;質(zhì)膜透性的測定參照張以順等[24]的相對電導(dǎo)率法。
采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并作圖,用SPSS statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析,以Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。3次重復(fù)測得的各項生理指標(biāo)數(shù)據(jù),取其平均值繪圖分析。
由圖1可知,在各種混合鹽堿脅迫濃度下,A組處理含量均與對照組差異顯著(P<0.05),且增幅最大,分別為20.77%、24.64%、31.33%、35.11%;在100 mmol/L和150 mmol/L鹽堿脅迫下,A、C、D組均與對照差異顯著;在大于50 mmol/L鹽堿脅迫下,B組均與對照差異不顯著。表明A組處理的黃芩幼苗膜脂化程度明顯高于B組,對黃芩幼苗的損傷較大。從相同鹽堿處理不同濃度來看,隨著混合鹽堿脅迫濃度的增加,MDA含量整體呈上升的趨勢,均在200 mmol/L鹽堿脅迫下MDA含量達(dá)到最高值,與對照相比分別增加了35.11%、9.44%、15.54%、19.83%,說明200 mmol/L鹽堿脅迫對MDA含量影響顯著。
圖1 混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗MDA含量的影響
由圖2可知,在50 mmol/L鹽堿脅迫下,各組處理黃芩幼苗葉綠素含量均與對照相比差異顯著(P<0.05),且在100 mmol/L鹽堿脅迫下,C、D組和對照組之間差異不顯著;在150 mmol/L鹽堿脅迫下,A、B、D組與對照組之間差異不顯著;在200 mmol/L鹽堿脅迫下,A、B、C、D組與對照之間差異顯著。在各種濃度處理下,A組葉綠素含量始終高于其它處理,反映出中性鹽(A組)對黃芩幼苗葉綠素含量影響顯著。從相同鹽堿處理不同濃度來看,隨著混合鹽堿脅迫濃度的增加,葉綠素的含量整體上呈現(xiàn)出先升后降趨勢,即呈現(xiàn)“低促高抑”。在50 mmol/L處理時與對照相比達(dá)到最大增幅,分別為14.82%、8.26%、1.50%和10.69%。在100 mmol/L鹽堿脅迫下,葉綠素含量降低,但大于對照組;當(dāng)鹽堿脅迫濃度大于100 mmol/L時,葉綠素含量低于對照組,說明50 mmol/L鹽堿脅迫對葉綠素含量影響顯著。
圖2 混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗葉綠素含量的影響
由圖3可知,經(jīng)不同濃度的混合鹽堿脅迫處理后,黃芩幼苗的SOD活性與對照組差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在50、100和150 mmol/L鹽堿脅迫下,A組處理中SOD保護(hù)酶活性與對照相比增幅分別為17.92%、20.94%和32.33%;而在200 mmol/L鹽堿脅迫下,SOD活性與對照組差異不大,并在D組處理下SOD活性低于對照組,說明高濃度的堿性鹽脅迫顯著降低了SOD保護(hù)酶的活性。從相同鹽堿處理不同濃度來看,A、B、C 3組SOD活性隨著濃度增加呈現(xiàn)先增后降趨勢,均在150 mmol/L鹽堿脅迫下SOD活性與對照相比達(dá)到最大增幅,分別為32.33%、21.11%和25.13%;而當(dāng)鹽堿脅迫濃度大于150 mmol/L時,SOD活性逐漸降低。說明高濃度的鹽堿脅迫抑制了保護(hù)酶的活性,且在中性鹽脅迫(A處理)下表現(xiàn)突出。
圖3 混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗SOD活性的影響
由圖4可知,從相同鹽堿脅迫濃度分析,在50 mmol/L和100 mmol/L鹽堿脅迫下,A、B組與對照組之間POD活性差異顯著(P<0.05),且均在A組處理下與對照相比達(dá)到最大增幅,分別為60.71%和89.29%。在150 mmol/L鹽堿脅迫下,4組處理與對照組之間均達(dá)到顯著差異,并在A組處理下達(dá)到最大增幅,為137.24%。在200 mmol/L鹽堿脅迫下,A、B組與對照組之間POD活性差異顯著,在B組處理下達(dá)到最大增幅,為79.85%。表明中性鹽(A組)誘導(dǎo)了黃芩POD 活性的提高,并隨處理濃度升高呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。A、B、C、D 4組均在150 mmol/L鹽堿脅迫下,POD活性達(dá)到最大值,與對照相比增幅分別為137.24%、120.15%、38.27%和34.69%。表明相同鹽堿處理時,150 mmol/L濃度的脅迫對POD活性影響顯著。
圖4 混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗POD活性的影響
由圖5可知,經(jīng)混合鹽堿脅迫后,各組處理CAT活性與對照組相比,達(dá)到顯著差異(P<0.05)。在各相同濃度鹽堿脅迫下,CAT活性在各類型處理間呈現(xiàn)逐漸降低趨勢,且均在A組處理下與對照相比達(dá)到最大增幅,分別為118.66%、108.06%、86.81%、98.68%,表明中性鹽(A組)誘導(dǎo)了黃芩 CAT 活性的提高,并隨處理濃度增大呈先增后減的變化趨勢。在50 mmol/L鹽堿脅迫時與對照相比CAT增幅最大,分別為118.66%、102.29%、86.81%和39.01%,表明50 mmol/L鹽堿脅迫對CAT活性影響顯著。
圖5 混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗CAT活性的影響
從圖6可看出,混合鹽堿脅迫處理黃芩后,黃芩幼苗的相對電導(dǎo)率與對照組相比差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在4種鹽堿脅迫濃度下,均在A組處理時增幅最大,分別為17.53%、21.80%、61.07%、62.96%,表明中性鹽(A組)脅迫對黃芩幼苗的傷害較大,造成嚴(yán)重的內(nèi)含物外滲。從相同鹽堿處理不同濃度來看,黃芩幼苗葉片的相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)出逐漸升高趨勢,A、B、C、D 4組處理均在200 mmol/L鹽堿脅迫濃度下與對照相比達(dá)到最大增幅,分別為62.96%、52.50%、16.42%、34.78%,反映出200 mmol/L鹽堿脅迫對黃芩幼苗相對電導(dǎo)率的影響最為顯著。
圖6 混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗相對電導(dǎo)率的影響
當(dāng)植物遇到逆境脅迫和植株衰老的情況下,植物細(xì)胞膜系統(tǒng)均會受到損傷,導(dǎo)致發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng),從而形成主要產(chǎn)物之一丙二醛(MDA),通常膜損傷程度的大小可以通過其含量的多少來反映。郝鳳等[25]研究表明,紫花苜蓿葉片中MDA含量與鹽濃度成呈相關(guān);張恩平等[26]發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗子葉MDA含量經(jīng)NaCl處理后明顯增加;王志強等[27]通過試驗得出隨脅迫時間延長,不同脅迫濃度下酸棗幼苗體內(nèi)丙二醛含量呈逐漸升高趨勢。本研究表明,隨著鹽堿脅迫濃度的增加,MDA含量也不斷升高,這與前人的研究結(jié)論一致,說明在鹽堿脅迫條件下,黃芩幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)受到了不同程度的損傷,在200 mmol/L鹽堿脅迫時影響顯著,且中性鹽A組處理對黃芩幼苗的損傷較大。
葉綠素作為一種色素,對光合作用有著非常重要的意義,而光合作用作為植物生命的基礎(chǔ),是有機物及植物合成能量的根本來源。所有能進(jìn)行光合作用的生物體中都能產(chǎn)生葉綠素,葉綠素能使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,其含量的多少決定了植物光合作用的強弱。本研究發(fā)現(xiàn),在初始脅迫時,植物體內(nèi)會積累可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),有利于葉綠素的合成。因此,在50 mmol/L脅迫濃度下,葉綠素含量相比于對照會有一個微上升,但隨著脅迫濃度增加,黃芩葉綠素含量逐漸降低,這與陳菲[28]研究鹽堿脅迫對文冠果幼苗的影響所得結(jié)果一致。在本實驗各種濃度處理下,A組葉綠素含量始終高于其它處理,反映出中性鹽(A組)對黃芩幼苗葉綠素含量影響顯著。
植物在不利于其生長的鹽堿環(huán)境和衰老的情況下,為維持自身的正常生理活動,植物會采取提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)的活性,來降低體內(nèi)的活性氧數(shù)量,這是植物的應(yīng)激反應(yīng)策略[29]??寡趸富钚猿蔀槟婢趁{迫下監(jiān)測植物的重要指標(biāo)。陳菲[28]研究發(fā)現(xiàn)在不同鹽堿脅迫下,文冠果幼苗中SOD、POD、CAT活性隨脅迫濃度增加均不同程度地呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在低鹽濃度下植物可以通過提高保護(hù)酶活性來增強耐鹽性,從而減輕鹽堿對植株的傷害,但這種能力是有限的,當(dāng)鹽堿含量值高出一定程度后,酶活性降低。在本實驗中,SOD、POD、CAT活性隨鹽堿濃度的增加表現(xiàn)為先升后降趨勢,且均在中性鹽(A組)誘導(dǎo)了黃芩保護(hù)酶活性提高,影響效果最顯著。SOD、POD活性均在150 mmol/L處理下最大,而CAT不同,它在50 mmol/L脅迫下影響顯著。
植物遇到逆境脅迫后,膜脂結(jié)構(gòu)會被破壞,進(jìn)而使膜脂通透性增大,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)大量外滲,通常表現(xiàn)為外滲的越多,電導(dǎo)率就越大,所以可以采取電導(dǎo)儀測定植物葉片外滲電導(dǎo)率從而得知細(xì)胞膜受到傷害的程度。本研究發(fā)現(xiàn),伴隨混合鹽堿脅迫濃度的升高,相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸增大趨勢,即在200 mmol/L鹽堿脅迫時影響顯著,且在中性鹽(A組)脅迫下對黃芩幼苗的傷害較大,造成嚴(yán)重的內(nèi)含物外滲,其影響效果最顯著。
本研究發(fā)現(xiàn),中性鹽A組脅迫對黃芩幼苗生理特性影響顯著,表明黃芩適合微堿性環(huán)境,對pH值耐受性強,它對中性鹽的脅迫反應(yīng)比較敏感,而對堿性鹽比較遲鈍。本研究未涉及更高濃度的混合鹽堿脅迫對黃芩幼苗的影響,當(dāng)脅迫濃度超過一定的限度時其發(fā)揮的作用未知。因此,更高混合鹽堿脅迫濃度對黃芩幼苗的影響還有待進(jìn)一步研究。