臧立 王海濤

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤科 300211

0 引 言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，是女性患者癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1-3]。在乳腺腫瘤的亞型中，有15%～20%為伴有乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility genes，BRCA）種系突變的三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）[4-6]。TNBC作為很少表達(dá)雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)快速增長[2-3]。然而，因?yàn)槿狈?nèi)分泌治療和靶向治療方法，TNBC 在所有類型的乳腺癌中預(yù)后最差[7-9]。因此，確定治療TNBC 的分子靶點(diǎn)具有重要意義。

驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1（kinesin family member C1，KIFC1）是負(fù)端定向運(yùn)動(dòng)蛋白，與有絲分裂過程中的紡錘體形成、中心體聚集和微管運(yùn)輸有關(guān)[10-13]。KIFC1 屬于驅(qū)動(dòng)蛋白14 家族的C 型驅(qū)動(dòng)蛋白。此前的研究結(jié)果表明，KIFC1 參與卵母細(xì)胞發(fā)育[14]、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)[10]、雙鏈DNA 轉(zhuǎn)運(yùn)[15]、精子發(fā)生[16]等生物學(xué)功能。研究結(jié)果還表明，KIFC1 參與多種腫瘤，包括卵巢癌[17]、前列腺癌[18]、非小細(xì)胞肺癌[19]、食道鱗狀細(xì)胞癌[20]。此外，KIFC1 可作為非裔美國女性TNBC 的預(yù)后標(biāo)志物[21]。

在本研究中，研究TNBC 患者中KIFC1 蛋白的表達(dá)水平，論證KIFC1 蛋白的過表達(dá)與TNBC 不良臨床結(jié)局的關(guān)系并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010 年11 月至2020 年11 月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的TNBC 乳腺癌患者96 例，所有患者均為女性，年齡46.2 歲±5.93 歲。全部病例均經(jīng)過臨床病理證實(shí)，并具有完整的病例資料。收集患者的腫瘤組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常組織樣本。本研究中涉及的所有患者的資料及標(biāo)本采集工作均得到了患者的知情同意。

1.2 主要材料與儀器

BALB/c 裸鼠（18～22 g）（北京維達(dá)河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司），MCF-7 和MDA-MB-231 人源TNBC細(xì)胞株、青霉素、鏈霉素（美國模式培養(yǎng)物研究所），Eagle 最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Eagle's minimal essential medium，EMEM）、Dulbecco 改 良 Eagle 培 養(yǎng) 基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國GIBCO 公司），KIFC1 重組抗體（ab172620）、抗β-肌動(dòng)蛋白抗體（ab8227）、Ki67 重組抗體（ab16667）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（ab18197）（英國Abcam 公司），RNA iMAX 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司），SuperMix 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），全蛋白檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），聚偏氟乙烯[poly（vinylidene fluoride），PVDF]膜（美國Millipore 公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit8，CCK-8）（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO 公司）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

利用癌癥基因組圖集（the ca ncer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫[22]進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析KIFC1的mRNA 在TNBC 組織和正常組織中的表達(dá)情況，并探討其預(yù)后評(píng)估價(jià)值。用Kaplan-Meier 曲線分析KIFC1 高表達(dá)者和低表達(dá)者之間的生存差異。TCGA的網(wǎng)址為http://fireb rowse.org/。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測

首先對(duì)TNBC 組織進(jìn)行脫蠟處理；然后用梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，75%）水合；水合完畢后，裝入壓力為103 kPa 的高壓鍋中，使用檸檬酸緩沖液孵育30 min 提取抗原；之后用1∶100 稀釋的KIFC1 重組抗體進(jìn)行免疫染色；最后對(duì)抗體進(jìn)行酶促檢測。免疫組化結(jié)果由兩位獨(dú)立的病理專家進(jìn)行審查和評(píng)分。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7 細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基中，MDA-MB-231 細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基中，然后分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、100 U/L 的青霉素和0.1 mg/ml的鏈霉素。處理后的細(xì)胞均置于5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃保存。

1.3.4 轉(zhuǎn)染

為了探討KIFC1 對(duì)TNBC 細(xì)胞的影響，本研究中利用shRNA 載體建立敲低KIFC1 的MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞株。購買商品化的腺病毒（adenovirusassociatedvirus，AAV）載體進(jìn)行shRNA 克隆，目標(biāo)序列如下。sh1:5′-AAATTACCACATCCCACCCAAGA-3′；sh2:5′-AAACGTTGGACCAAGAGAACCAG-3′；sh3: 5′-AAGTGGACAGGATGAAGTGTTTG-3′；sh4:5′-AACAGCAAACTGACCTACCTGCT-3′。采用RNA iMAX 試劑轉(zhuǎn)染的MCF-7 和MDA-MB-231細(xì)胞為shRNA 組；以錯(cuò)義序列轉(zhuǎn)染的MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

使用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行cDNA 分析。首先，將TRIZOL 試劑加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，提取總RNA；然后，將分離出的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；最后，使用RT-PCR 方法對(duì)cDNA 進(jìn)行分析。

以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，引物如下。KIFC1 的正向引物為5'-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3'，反向引物為5'-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3'；β-actin 的 正 向 引 物 為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向引物為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。以β-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照，采用比較CT（cycle-threshold）值法對(duì)樣品擴(kuò)增進(jìn)行計(jì)算，再采用2-ΔΔCT法計(jì)算KIFC1 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 Western blot

使用蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法進(jìn)行評(píng)估。用含10%的聚丙烯酰胺的SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)樣本分離；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PDVF 膜上；用含5%脫脂乳的TBST 緩沖液進(jìn)行阻斷，用抗體在4 ℃下孵育過夜；將樣品與二抗在室溫下孵育1 h；用化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）法對(duì)條帶進(jìn)行可視化處理。使用β-actin 作為內(nèi)參。用PCNA 和Ki67 來反映TNBC 細(xì)胞的增殖活性。

1.3.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將每孔500 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中培養(yǎng)2 周，用甲醇固定菌落，用0.1%的結(jié)晶紫染色，方便獲取集落大小和數(shù)量。

1.3.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

使用CCK-8 試劑盒測定細(xì)胞存活率。在96 孔板上每孔接種2 000 個(gè)細(xì)胞，并于第3 天記錄細(xì)胞存活率。

1.3.9 裸鼠腫瘤生長實(shí)驗(yàn)

裸鼠的養(yǎng)育和操作經(jīng)過了天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。將4 周齡的雌性無胸腺BALB/c 小鼠分為兩組，分別在小鼠右側(cè)皮下注射上述細(xì)胞培養(yǎng)中成功建立的兩種穩(wěn)定MDA-MB-231細(xì)胞系（KIFC1 抑制組和對(duì)照組）。注射2 周后，每7 天測量腫瘤尺寸；注射7 周后處死小鼠，分離腫瘤組織并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。復(fù)合正態(tài)分布的樣本以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，臨床病理特征與KIFC1表達(dá)的相關(guān)性采用χ2分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)結(jié)果

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲取的相關(guān)數(shù)據(jù)集中包括癌旁正常組織291 例，TNBC 組織1 085 例。結(jié)果表明，TNBC 組織中KIFC1 mRNA 水平明顯低于正常組織（P＜0.001），如圖1 所示。此外，KIFC1 mRNA 水平與TNBC 患者的無病生存率相關(guān)（P=0.043），如圖2 所示。上述結(jié)果提示，KIFC1 在人TNBC 組織中表達(dá)增強(qiáng)，并與TNBC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 三陰性乳腺癌（TNBC）組織中驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1（KIFC1）的mRNA 表達(dá)

圖2 驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1（KIFC1）的表達(dá)與三陰性乳腺癌（TNBC）患者無病生存率的相關(guān)性

2.2 KIFC1 的表達(dá)與TNBC 的臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化結(jié)果表明，KIFC1 在TNBC 組織中的高表達(dá)率為58.3%（56 例/96 例），低表達(dá)率為41.7%（40 例/96 例），而KIFC1 在癌旁正常組織中主要是低表達(dá)或無表達(dá)（圖3）。進(jìn)一步分析KIFC1 的表達(dá)與TNBC 的臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，KIFC1 在TNBC 組織中的表達(dá)與腫瘤分級(jí)相關(guān)（P=0.016），且高表達(dá)KIFC1 者有發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的趨勢。但是KIFC1 高表達(dá)和低表達(dá)者在年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

圖3 三陰性乳腺癌（TNBC）組織和癌旁正常組織中驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1（KIFC1）的免疫組化染色圖像

表1 三陰性乳腺癌（TNBC）患者的驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1（KIFC1）表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

上述結(jié)果表明，KIFC1 在TNBC 組織中的表達(dá)水平很高，并且與臨床病理特征相關(guān)。

2.3 KIFC1 對(duì)體外TNBC 細(xì)胞增殖能力的影響

用RT-PCR 和Western blot 方法驗(yàn)證敲低KIFC1 的MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，shRNA1（sh1）的敲低效果最明顯。

圖4 KIFC1 敲低前后的MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平

平板菌落實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)KIFC1 被敲低時(shí)，MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的克隆形成能力降低；CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)KIFC1 基因被敲低時(shí)，MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的活力和增殖能力均下降；Western blot 結(jié)果表明，敲低KIFC1 基因的MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞的Ki67 和PCNA 表達(dá)量均顯著降低，說明敲低KIFC1 后，細(xì)胞的增殖受到抑制。（圖5）

圖5 敲低KIFC1 對(duì)MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力的影響

上述結(jié)果表明KIFC1 在體外能顯著促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖。

2.4 KIFC1 對(duì)體內(nèi)TNBC 細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，敲低KIFC1 的小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（圖6）。Western blot 結(jié)果顯示，敲低KIFC1 的小鼠的KIFC1 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（圖7A）；而免疫組化結(jié)果與Western blot 結(jié)果一致（圖7B）。上述結(jié)果表明，KIFC1 在小鼠體內(nèi)能促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖。

圖6 敲低KIFC1 后小鼠體內(nèi)腫瘤體積的變化

圖7 敲低KIFC1 后小鼠KIFC1 的表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

TNBC 是所有乳腺癌中預(yù)后最差的惡性腫瘤亞型[9,23]。然而，TNBC 患者缺乏內(nèi)分泌治療和靶向治療。因此，需要新的方法和策略來治療TNBC。在本研究中發(fā)現(xiàn)KIFC1 在大多數(shù)TNBC 患者中表達(dá)，其表達(dá)水平與TNBC 患者的無病生存期相關(guān)。與本研究的結(jié)果類似，已有報(bào)道KIFC1 蛋白表達(dá)升高與卵巢癌[17]、前列腺癌[18]、非小細(xì)胞肺癌等預(yù)后較差相關(guān)[19-20,24-25]。因此，KIFC1 在未來有可能將成為TNBC治療的新靶點(diǎn)。

KIFC1 是負(fù)端定向運(yùn)動(dòng)蛋白，與有絲分裂過程中的紡錘體形成、中心體聚集和微管運(yùn)輸有關(guān)[10,13]。KIFC1 通過輸入RanGTP 和α/β 酶，并與未定義的核孔蛋白配合物相互作用，將相關(guān)蛋白運(yùn)到細(xì)胞核中[16，26-27]。在其他腫瘤中，KIFC1 有促進(jìn)腫瘤增殖的作用[19，28-29]。本文中，探討了KIFC1 對(duì)TNBC 的增殖作用，通過建立兩個(gè)敲低KIFC1 的TNBC 細(xì)胞系，體外研究了KIFC1 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。此外，基于KIFC1 敲低小鼠模型，用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了KIFC1 對(duì)TNBC 細(xì)胞的增殖作用。

Xiao 等[25]報(bào)道KIFC1 在膀胱癌中也可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生。Maurizio 等[30]發(fā)現(xiàn)KIFC1 在高遷移率族蛋白A1(high mobility group protein A1，HMGA1)沉默的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低。HMGA1 可誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3） 的 表 達(dá)，STAT3 也 上 調(diào)HMGA1，導(dǎo)致兩種基因表達(dá)增強(qiáng)[31]。Han 等[32]關(guān)注KIFC1 的上游，其報(bào)道稱KIFC1 受miR-532-3p 調(diào)控，然后通過gankyrin/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)EMT 和肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。

本研究存在以下幾點(diǎn)缺陷：一是預(yù)后結(jié)果主要來自公共數(shù)據(jù)庫；二是組織標(biāo)本數(shù)量較少，且沒有進(jìn)行多中心研究；三是針對(duì)機(jī)制的研究不足。因此，應(yīng)在未來對(duì)KIFC1 進(jìn)行更深入的研究，以便進(jìn)一步揭示KIFC1 對(duì)TNBC 的作用機(jī)制。

綜上所述，KIFC1 是TNBC 的預(yù)后因素，KIFC1在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果為KIFC1 作為TNBC 潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突