趙高傳 陳卿奇 龐 莉 程 正

(海南洋浦經(jīng)濟開發(fā)醫(yī)院消化內(nèi)科,洋浦 578101)

胃癌是胃黏膜上皮的常見消化道惡性腫瘤，其致死率高居癌癥相關死因的第2位，已成為嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一[1]。目前，根治性切除術是治療胃癌的主要手段之一，但仍有部分患者手術療效欠佳，術后5年生存率較低。因此，早期預判胃癌患者的預后情況并及時進行干預對提高患者的生存率具有重要意義。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度在21～25 nt的非編碼小分子RNA，參與細胞增殖、分化、凋亡和新陳代謝等過程，在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-144及miR-203在胃腸道腫瘤患者中異常表達，并能通過調(diào)控多種信號通路參與胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能在胃腸道腫瘤的診斷、治療和預后方面扮演重要角色[3-4]。然而，關于血清miR-144及miR-203表達水平對胃癌診斷及預后評估的研究鮮有報道。本研究通過檢測胃癌患者術前血清miR-144及miR-203表達水平，分析其對胃癌診斷及預后評估的價值，旨在為胃癌的診斷及靶向治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料 選取2015年1月1日至2017年12月31日海南洋浦經(jīng)濟開發(fā)醫(yī)院和海南西部中心醫(yī)院行胃癌根治術治療的胃癌患者106例，其中男74例，女32例，年齡36～82歲，中位年齡61.70歲。納入標準：①根據(jù)胃鏡檢查及組織病理學結果診斷為胃癌，參照WHO胃癌的病理學分類；②胃癌患者均常規(guī)行標準胃癌根治術治療(D2術式)，即胃大部分或全胃切除加清除胃周第二站淋巴結，術后根據(jù)患者情況行輔助化療；③能配合本次研究及病歷資料完整者。排除合并其他惡性腫瘤，無法配合本次研究者。另選取同期45例體檢健康對照組，其中男30例，女15例，年齡35～79歲，中位年齡60.80歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1研究方法 采用前瞻性研究方法對106例胃癌患者進行隨訪，患者術后最初2年每3個月返院隨訪1次，以后每6個月1次，由專職人員采用電話或門診等方式對患者或家屬進行隨訪，截止時間為2019年5月31日?？偵鏁r間(overall survival,OS)定義為術后第1天至患者死亡的時間。無進展生存時間(progression-free survival,PFS)定義為術后第1天起，未發(fā)生復發(fā)、原發(fā)器官腫瘤轉(zhuǎn)移及其他原因引起死亡的時間。納入本研究的變量包括患者年齡、性別、臨床癥狀、TNM分期、分化程度、侵犯深度、脈管瘤栓、淋巴結轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移等情況。

1.2.2miR-144及miR-203檢測 miR-144引物：上游：5′-ACTAGATGCTACTAGCAGACG-3′，下游：5′-GATCAGTAGTGAGACTAG-3′；miR-203引物：上游：5′-GCATGCAGTATGTCTATCAG-3′，下游：5′-ACTAGACTAGATAGTCAG-3′。所有患者均于術前抽取空腹靜脈血5 ml置于未加抗凝劑的離心管中，3 500 r/min 離心10 min，吸取上層血清400 μl，加入1 ml提取劑(TRIzol)，于-70℃保存。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行RT-PCR。反應體系為20 μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μl，cDNA 1.33 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μl，ddH2O 7.67 μl，混合后離心放入定量PCR儀。擴增條件為：95℃預變性10 min、95℃變性15 s、60℃復性60 s進行45個循環(huán)，實驗重復3次。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-144及miR-203的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

2 結果

2.1胃癌組和對照組血清miR-144及miR-203表達水平比較 胃癌組血清miR-144表達水平(0.23±0.05)明顯低于對照組(1.17±0.60)，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.627，P<0.001)；胃癌組血清miR-203表達水平(0.38±0.12)明顯低于對照組(1.05±0.46)，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.215，P<0.001)。見圖1。

圖1 胃癌組和對照組血清miR-144及miR-203表達水平比較

2.2血清miR-144及miR-203表達水平診斷胃癌的價值 血清miR-144表達水平診斷胃癌的最佳截斷值為0.53，曲線下面積(area under cure，AUC)為0.856(95%CI：0.797～0.917)，其敏感度和特異度為86.2%和82.7%。血清miR-203表達水平診斷胃癌的最佳截斷值為0.62，AUC為0.814(95%CI：0.753～0.875)，其敏感度和特異度為82.0%和78.0%。見圖2。

圖2 血清miR-144及miR-203表達水平診斷胃癌的ROC曲線

2.3血清miR-144及miR-203表達水平與胃癌患者的臨床病理特征比較 以miR-144=0.53及miR-203=0.62為界值，將106例胃癌患者分為高miR-144組(miR-144≥0.53，n=30)和低miR-144組(miR-144<0.53，n=76)；高miR-203組(miR-203≥0.62，n=35)和低miR-203組(miR-203<0.62，n=71)。高miR-144組與低miR-144組的TNM分期、脈管瘤栓、淋巴結轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高miR-203組與低miR-203組的TNM分期、脈管瘤栓、淋巴結轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組的年齡、性別、飲酒史、分化程度、侵犯深度及腫瘤最大徑比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 血清miR-144及miR-203表達水平與胃癌患者的臨床病理特征比較[n(%)]

2.4miR-144及miR-203表達與胃癌患者預后不良的關系 106例胃癌患者中失訪4例，隨訪率為96.2%(102/106)，隨訪時間為8～58個月，中位隨訪時間為29個月。生存分析顯示，低miR-144組患者總生存率明顯低于高miR-144組，差異有統(tǒng)計學意義(31.7% vs 60.4%；Log-rankχ2=15.370，P<0.001)；低miR-144組患者無進展生存率明顯低于高miR-144組，差異有統(tǒng)計學意義(19.6% vs 42.8%；Log-rankχ2=11.206，P<0.001)，見圖3。低miR-203組患者總生存率明顯低于高miR-203組，差異有統(tǒng)計學意義(34.0% vs 58.2%；Log-rankχ2=12.183，P<0.001)；低miR-203組患者無進展生存率明顯低于高miR-203組，差異有統(tǒng)計學意義(22.5% vs 39.7%；Log-rankχ2=9.512，P<0.001)，見圖4。對單因素分析中有統(tǒng)計學意義的因素(TNM分期、脈管瘤栓、淋巴結轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、miR-144及miR-203)調(diào)入COX回歸分析模型，結果顯示腹膜轉(zhuǎn)移[HR(95%CI)=3.164(2.273～6.108)]、肝轉(zhuǎn)移[HR(95%CI)=1.905(1.217～4.106)]、miR-144<0.53[HR(95%CI)=2.730(1.981～5.394)]及miR-203<0.62[HR(95%CI)=2.181(1.562～4.775)]是影響胃癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

圖3 高miR-144組與低miR-144組胃癌患者總生存時間及無進展生存時間曲線比較

圖4 高miR-203組與低miR-203組胃癌患者總生存時間及無進展生存時間曲線比較

表2 影響胃癌患者預后不良的單因素及多因素COX回歸分析

3 討論

胃癌根治術是指原發(fā)腫瘤連同轉(zhuǎn)移淋巴結及受累浸潤的組織一并被切除的手術，并最大限度的保證腫瘤的徹底切除，減少局部的復發(fā)，從而達到治愈的效果[5]。然而，部分晚期患者的預后難以被準確地評估，其術后死亡率較高。因此，尋找用于胃癌個體化治療和預后評估的生物標志物具有重要意義。miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達，參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，有望成為腫瘤診斷和治療的重要靶點[6]。近期的研究表明，miR-144及miR-203在多種惡性腫瘤中異常表達，且不同惡性腫瘤中miR-144及miR-203的表達水平不同，miR-144及miR-203對惡性腫瘤的診斷、轉(zhuǎn)移及預后判斷等方面具有重要的價值[7-8]。

本研究顯示，胃癌組血清miR-144及miR-203表達水平均明顯低于對照組，提示血清miR-144及miR-203表達水平在胃癌患者中異常低表達，其可能通過發(fā)揮抑癌基因的作用來調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。MUSHTAQ等[9]研究顯示，與正常胃上皮細胞相比，miR-144在胃癌細胞中的表達明顯下調(diào)，miR-144的過度表達抑制了癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其在胃癌進展中起重要作用。LI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-203在胃癌組織和細胞系中表達下調(diào)，其下調(diào)促進了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，有可能在胃癌的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。本研究中隨著TNM分期增加、脈管瘤栓、淋巴結轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的胃癌患者，miR-144及miR-203的表達水平均下調(diào)，提示miR-144及miR-203低表達可能促進胃癌的進展過程，其低表達可導致一系列其靶向的癌基因過度激活，從而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。REN等[11]研究顯示，miR-144在胃癌組織中表達下調(diào)，其低表達與淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM期顯著相關，可促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。ZHOU等[12]研究認為，miR-203在胃癌組織和細胞中顯著下調(diào)，miR-203的高表達抑制了胃癌細胞的集落形成、遷移和侵襲，其可能是一種新的胃癌治療策略。另有研究表明，miRNA在胃癌患者中明顯升高，其可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展，其差異表達與腫瘤復發(fā)和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，是影響胃癌患者總生存率的獨立預后因素[13]。

本研究應用ROC曲線分析，結果顯示血清miR-144及miR-203表達水平診斷胃癌的最佳截斷值分別為0.53、0.62，以此為標準對胃癌患者進行分組，并分析miR-144及miR-203表達水平與胃癌患者生存時間之間的關系。結果顯示，低miR-144及miR-203組患者總生存率低于高miR-144及miR-203組，低miR-144及miR-203組患者無病生存率低于高miR-144及miR-203組。這說明miR-144及miR-203低表達與胃癌患者生存期短有關。此外，本研究進一步采用單因素及多因素COX回歸模型分析顯示，腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、miR-144<0.53及miR-203<0.62是影響胃癌患者預后不良的獨立危險因素。LIU等[14]研究顯示，miR-144在胃癌組織和血清中的表達明顯下調(diào)，miR-144水平較低的患者5年總生存率和無病生存率較差，可作為胃癌診斷及預后預測的潛在生物標志物。ZHENG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-203的表達明顯低于非癌組織，miR-203的低表達對總生存率和無進展生存率有顯著影響，是影響總生存率(HR=2.73，95%CI：1.69～8.91，P=0.01)和無進展生存率(HR=4.19，95%CI：2.91～10.12，P=0.005)的獨立預后因素。另有研究表明，血清miR-203的低表達與無病生存率和總生存率顯著相關，多因素分析顯示miR-203低表達、腹膜和遠處轉(zhuǎn)移是胃癌預后不良的獨立預測指標，有望作為胃癌患者預后預測的無創(chuàng)生物標志物[16]。

綜上所述，胃癌患者血清miR-144及miR-203表達水平下調(diào)，腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、miR-144<0.53及miR-203<0.62是影響胃癌患者預后不良的獨立危險因素，其中miR-144及miR-203低表達與胃癌患者生存期短有關，可能是預測胃癌患者預后不良的生物標志物。但本研究為單中心研究，病例來源較單一，缺乏多中心的研究結果，未來仍需大規(guī)模多中心的前瞻性研究進一步證實miR-144及miR-203與胃癌患者預后不良的關系。