唐興珈 傅 睿 李 群 劉小青 胡少凡

(江西省兒童醫(yī)院南昌大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎內(nèi)科,南昌 330006)

過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein Purpura,HSP)是一種由IgA介導(dǎo)的以全身小血管炎癥為主的變態(tài)反應(yīng)性疾病，常表現(xiàn)為皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)腫痛、血尿、蛋白尿等，可累及多個(gè)臟器，引起消化道出血、腎臟損傷等，嚴(yán)重影響患兒健康[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂參與狼瘡性腎炎、支氣管哮喘、新生兒濕疹等免疫相關(guān)性疾病發(fā)病過程，但腸道菌群與HSP，尤其是腎型HSP的發(fā)病機(jī)制是否相關(guān)尚不清楚[3-5]。本研究采用16S rRNA 測序技術(shù)，檢測HSP不同臨床表型患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性差異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 收集2018年5月至2019年5月江西省兒童醫(yī)院初次就診且診斷為HSP的患兒共30例為觀察組，其中單純紫癜型(B組)、消化道出血型(C組)、腎臟損傷型(D組)患兒各10例，招募同期年齡、性別與HSP患兒相匹配的健康兒童為對照組(A組)。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年EULAR/PRINTO/PRES共同制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①糞便采集前2個(gè)星期內(nèi)接受過抗生素、微生態(tài)制劑、免疫抑制劑、激素治療；②患有精神疾病或原發(fā)性免疫缺陷病者；③合并其他系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病者。

1.2方法

1.2.1糞便標(biāo)本及血液收集 收集所有受試者糞便入院后第1次大便并立即置于-80℃凍存，取清晨空腹靜脈血 5 ml，室溫靜置20 min，3 000 r/min離心10 min，收集血清-20℃保存待用。

1.2.2DNA提取 采用糞便DNA快速提取試劑盒進(jìn)行糞便基因組DNA提取，按照試劑盒說明書操作。

1.2.3DNA 16S rRNA V4區(qū)檢測 對DNA 16S rRNA進(jìn)行高通量測序，高通量測序及測序文庫構(gòu)建由華大基因檢測中心完成。

1.2.4生物信息學(xué)分析 通常將相似度在97%以上的序列聚類作為1個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，采用OTU的Venn圖分析得到各組樣品OTU數(shù)，Venn圖展示多組樣品共有和特有OTU數(shù)，直觀展示各組樣品間 OTU 重疊情況，結(jié)合OTU所代表的物種找出不同研究個(gè)體的核心微生物。Alpha多樣性是對單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，如shannon指數(shù)可反映群落多樣性，受群落中物種豐度和均勻度的影響，相同豐度群落中各物種均勻度較大則認(rèn)為群落具有多樣性。

1.2.5臨床指標(biāo)檢測 采用IL-6、IL-8、IL-10 ELISA試劑盒檢測血清IL-6、IL-8、IL-10水平，采用全自動免疫化學(xué)發(fā)光法檢測血清IgA、IgG、IgM、IgE水平。

2 結(jié)果

2.1一般資料比較 HSP不同臨床表型患兒30例，其中單純紫癜型10例，平均年齡(5.89±3.57)歲，男6例，女4例；消化道出血型10例，平均年齡(6.18±3.42)歲，男6例，女4例；腎臟損傷型10例，平均年齡(7.41±3.27)歲，男3例，女7例。HSP不同臨床表型患兒給予對癥支持治療后，癥狀好轉(zhuǎn)出院。對照組兒童10例，平均年齡(5.63±3.57)歲，男5例，女5例。4組兒童年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.17，χ2=2.45，P>0.05)，見表1。

表1 一般資料比較例(%)]

2.2測序與質(zhì)量控制 經(jīng)測序共獲得Raw Reads 6 551 486條，優(yōu)化后獲得Clean Reads 共6 418 300條，各樣本平均160 456條，最多為160 544條/樣本，最少為160 306條/樣本，測序覆蓋度較好，拼接后共獲得序列3 200 920條，總序列平均504 bp，共獲得OTU 692個(gè)。shannon指數(shù)曲線隨測序深度增加趨向于平坦，表明測序數(shù)據(jù)樣本量足以反映各組微生物信息(圖1)。

圖1 shannon指數(shù)值與樣品深度的關(guān)系

2.3OTU的Venn圖分析 觀察組和對照組共產(chǎn)生OTU 692個(gè)，共有OTU 340個(gè)，其中對照組兒童OTU 441個(gè)，不同臨床表型HSP患兒OTU分別為500個(gè)(B組)、554個(gè)(C組)、533個(gè)(D組)，明顯高于對照組。觀察組特有OTU數(shù)較對照組高，其中B組26個(gè)，C組56個(gè)，D組36個(gè)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，滿足歸類分析要求(圖2)。

圖2 腸道菌群的OTU 交疊Venn圖

2.4物種及其豐度分析

2.4.1門分類水平比較 4組患兒腸道菌群均以Firmicutes(厚壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)為優(yōu)勢菌群，3個(gè)門類中所占比例分別為A組93.65%、B組98.95%、C組95.62%、D組96.19%。結(jié)合門水平差異篩選物種，在變形菌門中，C組豐度明顯高于B、D組(P<0.05，圖3)。

圖3 4組樣本腸道菌群門分類水平的相對豐度

2.4.2屬分類水平比較 4組研究對象中，腸道菌群均以擬桿菌屬、糞桿菌屬、普雷沃氏菌屬、巨單胞菌屬、埃希菌屬為優(yōu)勢菌屬(圖4)。Kruskal-Wallis分析發(fā)現(xiàn)，不同臨床表型的HSP患兒中普雷沃氏菌屬、芽殖菌屬、梭形桿菌屬存在顯著差異(P<0.05，表2)，且普雷沃氏菌屬豐度由高到低為腎臟損傷型>單純紫癜型>消化道出血型；芽殖菌屬豐度由高到低為腎臟損傷型>單純紫癜型>消化道出血型；梭形桿菌屬豐度由高到低為消化道出血型>腎臟損傷型>單純紫癜型。

表2 4組樣本腸道菌群屬水平差異比較

圖4 4組樣本腸道菌群屬水平分布

2.5差異細(xì)菌種類 A組γ-變形菌綱豐度較高；B組雙歧桿菌屬(門到屬水平)豐度降低；C組變形菌門、δ變形菌綱、脫硫弧菌科(目到科水平)、Oscillospira屬、Parabacteroides屬豐度提高，而雙歧桿菌科(目到科水平)和鏈球菌科(目到科水平)豐度降低；D組脫硫弧菌屬(目到屬水平)、普雷沃氏菌屬(科到屬水平)、芽殖菌屬、Barnesiellaceae科豐度提高，而乳酸桿菌目、雙歧桿菌屬豐度降低(圖5)。

圖5 GraPhlAn腸道菌群組成圖

2.6腸道菌群與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 HSP患兒血清IL-6、IL-8、IgA水平明顯高于健康兒童，且腎臟損傷型HSP患兒組血清IL-6、IL-8、IgA水平均高于單純紫癜型HSP患兒(P<0.05)；各組IL-10、IgG、IgM及IgE水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HSP患兒屬水平的3種細(xì)菌與5個(gè)臨床指標(biāo)顯著相關(guān)(>0.22或<-0.22，P<0.05，圖6)，其中芽殖菌屬與IL-6、sIgA、IgG呈正相關(guān)(r=0.245、0.407、0.245,P<0.05)，普雷沃氏菌屬(Prevotella)與IL-8水平呈正相關(guān)(r=0.430,P<0.05)，而雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)與IL-10水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.382,P<0.05)。

圖6 通過Spearman相關(guān)性分析HSP患兒腸道菌群和臨床指標(biāo)相關(guān)性的熱圖

表3 臨床指標(biāo)比較

3 討論

過敏性紫癜常見于兒童，是一種累及皮膚、消化道、腎臟等器官的小血管和毛細(xì)血管炎癥，可導(dǎo)致多臟器損傷，臟器受累是影響HSP患兒預(yù)后的主要原因。HSP的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，研究表明微生物的多樣性與人體發(fā)育和功能免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，也提出了“微生物-腦-腸軸”“腸-腎軸”學(xué)說，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腎臟疾病研究提供了新的思路[7-8]。本研究通過檢測HSP不同臨床表型患兒腸道菌群的變化，探討腸道菌群紊亂與HSP患兒臟器損傷的關(guān)系。

本研究顯示，HSP不同臨床表型OTU 數(shù)存在差異，且shannon指數(shù)曲線隨測序深度增加趨于平坦，故各組納入的樣本量可反映各組微生物信息，進(jìn)一步菌群差異分析發(fā)現(xiàn)，HSP不同臨床表型患兒腸道菌群在門、綱、目、科、屬、種水平存在差異，且HSP患兒的有害菌群或條件致病菌豐度提高，與既往研究HSP患兒Parabacteroides、變形菌門等有害菌群豐度較健康兒童升高的結(jié)果一致[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童相比，HSP腎損傷型患兒芽殖菌種(屬到種水平)、普雷沃氏菌種(科到種水平)、脫硫弧菌屬(目到屬水平)、Barnesiellaceae科豐度提高，芽殖菌、脫硫弧菌可，引起腸道慢性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)芽殖菌在炎癥性腸病患者中打破腸道菌群平衡，且脫硫弧菌可使蛋氨酸產(chǎn)生高濃度硫化氫，從而抑制細(xì)胞色素C氧化酶，降低細(xì)胞呼吸作用，損傷腸黏膜上皮細(xì)胞，破壞腸黏膜屏障功能[10-15]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP腎臟損傷型患兒芽殖菌和脫硫弧菌豐度高于其他組，說明HSP腎臟損傷型患兒腸道菌群平衡被破壞。普雷沃氏菌為嚴(yán)格厭氧菌，是口腔中的優(yōu)勢菌，且細(xì)菌表面的LPS可誘導(dǎo)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)[16-17]；Barnesiellaceae科可促進(jìn)腸道菌群炎癥反應(yīng)，增加腸道通透性[18]；研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒尤其是腎臟損傷型患兒血清中IL-6、IL-8、IL-10和IgA等免疫因子呈高表達(dá)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)芽殖菌屬豐度與血清中IL-6、IgA、IgG水平呈正相關(guān)，普雷沃氏菌屬豐度與IL-8呈正相關(guān)，提示腸道菌群改變與HSP腎臟損傷型患兒全身免疫反應(yīng)過程及腎臟損傷有關(guān)。HSP腎臟損傷型患兒中以上腸道菌群豐度提高導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、腸道通透性增加，從而使腸道內(nèi)毒素透過血液循環(huán)導(dǎo)致腎臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童相比，HSP消化道出血型患兒變形菌門、δ變形菌綱、脫硫弧菌科(目到科水平)、Oscillospira屬、Parabacteroides屬豐度提高，其中變形菌門為革蘭氏陰性菌，是兼性厭氧菌，包括多種病原微生物，在健康機(jī)體內(nèi)變形菌門比厚壁菌門和擬桿菌門豐度降低，其在口腔中豐度較高，而在腸道內(nèi)豐度較低，變形菌門豐度提高可作為腸道菌群紊亂的標(biāo)志，本研究發(fā)現(xiàn)HSP消化道出血型患兒組變形菌門豐度明顯高于其他組，說明HSP消化道出血型患兒存在更明顯的腸道菌群紊亂。δ變形桿菌是一種含LPS較多的桿菌，其數(shù)量增加可導(dǎo)致較多的LPS 進(jìn)入腸道黏膜并透過黏膜進(jìn)入血液，LPS 可引起腸道內(nèi)先天性免疫系統(tǒng)反應(yīng)，從而引發(fā)局部炎癥反應(yīng)[21-22]。研究顯示，脫硫弧菌、Parabacteroides屬均可影響腸道菌群通透性，Parabacteroides屬與腸道的緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，從而影響腸道通透性，因此HSP患兒消化道出血與變形菌門、δ變形菌綱、脫硫弧菌、Oscillospira屬、Parabacteroides屬豐度提高密切相關(guān)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童相比，HSP單純紫癜型患兒中梭形桿菌屬(門到屬水平)豐度降低；目前認(rèn)為梭形桿菌可產(chǎn)生丁酸，以丁酸為主的短鏈脂肪酸可通過影響5-HT釋放改變結(jié)腸組織鈉水吸收能力及直接影響腸道平滑肌收縮等機(jī)制影響腸道運(yùn)動，可能與部分HSP患兒出現(xiàn)便秘有關(guān)[24-26]。與健康兒童相比，HSP不同臨床表型患兒均存在腸道菌群紊亂。

本研究發(fā)現(xiàn)，HSP不同臨床表型患兒存在不同程度腸道菌群變化，與HSP單純紫癜型患兒相比，腎臟損傷型HSP患兒普雷沃氏菌科、Barnesiellaceae科豐度明顯提高，消化道出血型患兒梭形桿菌屬(門到屬水平)豐度明顯提高，與HSP消化道出血型患兒相比，腎損傷型患兒芽殖菌種(屬到種水平)豐度明顯提高；芽殖菌可破壞腸道菌群平衡，且普雷沃氏菌、Barnesiellaceae菌可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而破壞腸道屏障，可能促使炎癥因子通過腸道屏障到達(dá)全身臟器，導(dǎo)致臟器損傷，如腎損傷。梭形桿菌在HSP消化道出血型患兒中豐度明顯高于單純紫癜型患兒、腎臟損傷型患兒，腸道中高豐度的梭形桿菌可產(chǎn)生大量丁酸，GE等[27]灌胃給予小鼠丁酸后糞便含水量升高，可能是引起部分消化道出血患兒出現(xiàn)血水樣大便的原因。不同的腸道菌群變化可能是導(dǎo)致HSP患兒出現(xiàn)不同臨床表型的原因，且隨臟器損傷加重，有害菌群或機(jī)會致病菌豐度提高更為顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)HSP不同臨床表型患兒有益菌群豐度降低，與既往研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒雙歧桿菌、鏈球菌等有益菌群豐度降低結(jié)果一致[28]。本研究顯示，HSP腎臟損傷型患兒中乳酸桿菌目、雙歧桿菌屬豐度明顯降低，雙歧桿菌和乳酸桿菌有助于恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分泌黏蛋白，促進(jìn)潘氏細(xì)胞分泌sIgA，在腸道局部產(chǎn)生免疫作用，對全身性免疫反應(yīng)也有一定調(diào)節(jié)作用[29]。HSP消化道出血型患兒中，雙歧桿菌科(目到科水平)和鏈球菌科(目到科水平)豐富明顯降低，鏈球菌為厚壁菌門，部分鏈球菌可引發(fā)人腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等疾病，但大多數(shù)鏈球菌在體內(nèi)并不致病，在人皮膚、口腔、消化道等部位形成與人體共生的正常菌群，人乳汁中也含有鏈球菌[30]。HSP單純紫癜型患兒中，雙歧桿菌屬(門到屬水平)豐度明顯降低，雙歧桿菌可消耗人乳中復(fù)雜寡糖，抵抗腸道病原菌定植和入侵、增強(qiáng)腸道上皮的屏障作用，其代謝產(chǎn)物還可增強(qiáng)腸道的防御作用，是黏附于腸黏膜上皮的有益菌，研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者腸道菌群中雙歧桿菌水平較健康志愿者降低，含有雙歧桿菌的益生菌可減輕潰瘍性結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)及預(yù)防貯袋炎[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP不同臨床表型患兒隨臟器損傷加重，有益菌群豐度降低更為明顯，且雙歧桿菌屬豐度下降，與既往HSP患者腸道菌群研究雙歧桿菌減少結(jié)論一致[32]。本研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌豐度降低與血清中IL-10水平提高有關(guān)，雙歧桿菌豐度降低可能與HSP患兒疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

綜上，本研究初步揭示HSP不同臨床表型患兒腸道菌群組成結(jié)構(gòu)和多樣性具有明顯差異，在臨床應(yīng)用中可通過選擇相應(yīng)的益生菌制劑，如雙歧桿菌和乳酸桿菌調(diào)節(jié)胃腸道菌群治療兒童HSP，并可通過腸道菌群豐度檢測診斷是否存在臟器損傷，但由于16S rRNA基因測序技術(shù)的局限性及納入樣本量有限，后續(xù)將增大樣本量并采用宏基因技術(shù)找出差異基因，進(jìn)一步探討菌群結(jié)構(gòu)和多樣性改變治療HSP不同臨床表型的內(nèi)在機(jī)制，為HSP不同臨床表型患兒的診治提供依據(jù)。