邢 雪 袁啟航 葉小康 李 霞 陸智敏

(大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，大連 116044)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多種淋巴細胞異?；罨投嗥鞴偈芾蹫樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊1]。免疫學家一直致力于適應性免疫細胞(包括T細胞和B細胞)在SLE發(fā)病中的機制研究，關于天然免疫核心細胞自然殺傷細胞(natural killer，NK)的研究仍較少[2]。NK細胞占外周血淋巴細胞總數的5%～20%，在抗感染免疫、腫瘤免疫及免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁[3-4]。目前多數研究提示NK細胞在SLE中數量異常，但機制尚不清楚[4-6]。且糖皮質激素及免疫抑制劑本身也會影響NK細胞數量及功能，為了進一步探究NK細胞在SLE中的變化及作用，本文將分析初治SLE患者(未使用糖皮質激素及免疫抑制劑)外周血中NK細胞的變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1病例選擇 該研究為橫斷面研究。選取2018年1月至2018年12月于南通大學附屬醫(yī)院就診的初治SLE患者(未使用糖皮質激素及免疫抑制劑)42例，均符合美國風濕病學會(ACR)1997年修訂的SLE分類診斷標準，排除感染、腫瘤及其他自身免疫病[7]。疾病活動評分采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動評分(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[8]。其中女性38例，男性4例，平均年齡(37.1±14.1)歲；另選正常對照組25例，其中女性22例，男性3例，平均年齡(32.3±8.9)歲，均來自南通大學附屬醫(yī)院體檢中心的健康人群，無風濕病史和風濕病家族史。各組年齡、性別差異比較均無統(tǒng)計學意義。狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)定義為24 h尿蛋白大于0.5 g或尿沉渣(WBC>5/HP or RBC >5/HP)或腎活檢證實。42例SLE患者LN組18例，無LN組24例。本研究取得所有受試者的知情同意并獲得南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批件號：2016-041)。

1.1.2主要試劑與儀器 FITC-conjugated anti-CD3及 PE-conjugated anti-CD56 購于美國BD公司；鼠抗人 FITC-and PE-conjugated IgG1 作為同型對照；人淋巴細胞分離液購于中國醫(yī)學科學院生物工程研究所。FACSCalibur型流式細胞儀購于美國BD公司；流式分析軟件為FCS ExpressV3(De Novo Software，Canada)。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集肝素抗凝外周血4 ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，800 g離心30 min，計數。

1.2.2NK細胞數量的檢測 PBMC經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，調整細胞濃度為2×106個/ml，加入FITC-CD3、PE-CD56，對照管加相應的同型對照，常溫避光20 min，1 ml PBS洗滌。分析CD3-CD56+細胞占百分率并計算絕對數。

1.2.3臨床指標的檢測 白細胞(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(blood hemoglobin，Hb)、血小板(blood platelet，PLT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate ,ESR)、C反應蛋白(serum levels of C-reactive protein,CRP)、補體C3、補體C4、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、抗dsDNA抗體、抗核抗體(ANA)、24 h尿蛋白定量常規(guī)檢測。

2 結果

2.1初治SLE患者臨床資料 42例初治SLE患者基本臨床資料見表1。平均年齡為(37.1±14.1)歲，女性38例，男性4例，病程(36.1±57.9)個月。SLEDAI評分為(10.52±4.96)分。

表1 初治SLE患者臨床資料

2.2初治SLE患者外周血中NK細胞變化 初治SLE患者外周血中NK細胞占淋巴細胞百分率為(5.8±3.8)%，低于正常對照組的(13.4±4.9)%(P<0.01)。與正常對照組相比，SLE患者外周血中NK細胞絕對數顯著下降[(267.9±111.9)個/μl vs(60.3±46.2)個/μl](P<0.01)。初治SLE患者SLEDAI評分為10.52±4.96。根據SLEDAI評分分為不活動5例(0～4分)，輕度活動12例(5～10分)，中重度活動25例(大于10分)。與不活動組相比，中重度活動組NK細胞絕對數顯著下降[(49±34)個/μl vs(108±51)個/μl](P<0.01)。見圖1。

圖1 初治SLE患者外周血中NK細胞變化

2.3SLE患者外周血中NK細胞數量與臨床指標的相關性分析 NK細胞絕對數與SLEDAI評分呈負相關(r=-0.365，P=0.018)。SLE患者外周血PLT計數為(188.4±92.0)×109個/L，補體C3(0.49±0.24)g/L。PLT(r=0.343，P=0.026)及補體C3(r=0.445，P=0.003)均與NK細胞絕對數呈正相關。抗dsDNA抗體滴度與NK細胞絕對數有負相關趨勢(r=-0.263，P=0.093)，見圖2。NK細胞數量與血清補體C4、ESR、CRP、免疫球蛋白均無顯著相關性。

圖2 初治SLE患者外周血中NK細胞絕對數與疾病活動度相關性分析

2.4LN組NK細胞數量顯著減少 LN組外周血NK細胞絕對數明顯低于無LN組(43.8±48.9 vs 72.6±40.8，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。兩組NK百分率無統(tǒng)計學差異(4.9±3.7% vs 6.4±3.9%，P=0.238)。見圖3。

圖3 LN患者外周血中NK細胞變化

3 討論

SLE是自身免疫病的原型疾病，好發(fā)于育齡期女性，全身各臟器均可受累；以自身DNA及RNA大量釋放及淋巴細胞活化產生多種自身抗體為特征[1]。近年來，早期發(fā)現、規(guī)范治療使SLE患者生存期延長，而感染成為SLE最常見的死亡原因[9-10]。與獲得性免疫缺陷病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)患者類似，SLE患者也是各種機會性感染(尤其病毒感染)的好發(fā)人群。此外，感染也是SLE患者疾病復發(fā)的主要因素之一。目前較公認的觀點是藥物使用及自身免疫功能異常均參與了SLE患者易感染及感染不易控制，但其機制尚未完全明確。

NK細胞是經典的固有免疫細胞，能迅速殺傷靶細胞(如病毒感染的宿主細胞)，且無MHC限制性，在機體抗感染免疫應答的早期發(fā)揮重要作用。同時NK細胞還具有強大的細胞因子分泌功能，不僅調節(jié)固有免疫應答，而且參與調節(jié)獲得性免疫應答，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁[3-4]。

目前多數研究均提示SLE患者外周血中NK細胞顯著減少[4-6,11-13]。由于糖皮質激素、免疫抑制劑會影響NK細胞的數量，本研究納入初發(fā)SLE患者(未使用糖皮質激素及免疫抑制劑)，同樣證實NK細胞絕對數及百分率均明顯下降，其中以絕對數顯著下降，不到正常人的四分之一，提示NK細胞在狼瘡疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

NK細胞表面活化性受體和抑制性受體處于動態(tài)平衡，對維持該細胞的功能發(fā)揮重要作用。關于各型受體在SLE患者外周血變化的研究尚存在爭議。HUANG等[13]發(fā)現抑制性受體CD158b 分子及活化受體CD16、CD226在SLE患者NK細胞上的表達均下降，其他抑制劑受體(NKG2A、CD94 和 CD85j)及活化性受體(NKG2D、NKp46 和 CD69)沒有差異。在部分活動期患者中藥物治療可有效恢復 CD226+NK細胞比例。HERVIER等[12]研究證實SLE患者外周血中NK細胞的細胞毒作用下降，分泌IFN-γ增多，其表面CD69和NKG2A表達增多，CD16和KIR(the killer cell immunoglobulin-like receptor)KIR2DL1/KIR2DS1表達減少。一項來自臺灣研究證實SLE患者體內NK細胞對IL-15反應減低，殺傷能力下降[14]。BANCHEREAU等[15]對于SLE患者全血指紋測序研究提示，SLE患者體內NK細胞的細胞毒性作用顯著減少。既往研究證實與正常組相比，SLE患者NK細胞表達穿孔素減少，表達顆粒酶B平均熒光強度增加，分泌IFN-γ增多；IL-15可以增強NK細胞IFN-γ/TNF-α分泌、穿孔素/顆粒酶以及CD107a脫顆粒表達[6]。以上關于NK細胞表型的研究尚有爭議，其在SLE患者中表型的變化需要更大樣本量的研究。

NK細胞的功能狀態(tài)是各型表面分子綜合作用的結果，不能單純的用活化和抑制來反映。不同藥物的治療及人群的選擇可能導致結果的差異，提示無糖皮質激素及免疫抑制劑治療患者的結果更能反映SLE患者體內NK細胞的真實狀態(tài)。研究證實SLE患者體內IFN-a導致NK細胞活化后凋亡增加，從而導致數量減少。該研究團隊同時發(fā)現CD226+NK細胞浸潤至狼瘡鼠的腎臟，并通過分泌細胞毒性顆粒和細胞因子發(fā)揮致病作用[13,16]。且LN患者腎臟組織病理中NK細胞表面活化受體NKG2D的配體MICA顯著增多[16]。本研究證實LN患者外周血NK細胞顯著低于無LN的SLE患者，推測NK可能通過趨化至局部發(fā)揮重要致病作用，進而導致外周血中數量的下降，具體機制有待進一步研究。

SEGERBERG等[17]研究提示抗KIR陽性SLE患者體內的IgG在體外可降低NK細胞對K562細胞的殺傷能力。近期研究發(fā)現部分活動性SLE患者外周血中存在抗CD94/NKG2A抗體和抗 CD94/NKG2C 抗體，該抗體可減少NK細胞某些亞群的數量及功能，在SLE疾病中發(fā)揮重要作用[18]。HANAOKA等[19]研究證實SLE患者體內NK細胞中的NKG2D可通過Caspase通路導致CD3ζ 信號傳導異常，在自身免疫病中發(fā)揮重要作用。哈佛大學研究團隊證實CD3ζ水平與NK細胞毒性作用相關，且NK細胞CD3ζ表達下調導致SLE患者NK細胞炎癥表型[20]。

此外有研究證實SLE患者外周血中NK細胞表達CD80、CD86及HLA-DR增高，可以調節(jié)DC細胞功能，進而在SLE疾病中發(fā)揮調節(jié)性功能。同時NK細胞可通過殺傷 iDCs抑制適應性免疫應答，并影響T細胞功能，推測其數量的減少可能導致適應性免疫異常加劇，雙鏈DNA抗體增加，患者疾病活動度增加，具體機制還有待進一步研究[21]。

本研究證實NK細胞減少與疾病活動評分、補體C3及抗dsDNA抗體顯著相關，提示NK細胞功能異常參與狼瘡疾病發(fā)生發(fā)展有關。補體可以通過DC細胞調節(jié)NK細胞的功能，推測低補體血癥時，NK細胞接受DC細胞的初始刺激異常，可能導致細胞數量及功能異常，具體機制還有待進一步研究[22]。且NK細胞為一線的抗感染細胞，其數量顯著減少可能與SLE患者容易發(fā)生機會性感染相關，推測調節(jié)NK細胞的數量及功能對控制狼瘡機會性感染及改善SLE預后有重要意義。

SLE中NK細胞存在數量及功能的異常，其在固有免疫及適應性免疫之間所起作用及機制充滿未知。對NK細胞在SLE發(fā)病機制中進行更深入研究可能會開創(chuàng)SLE新的治療策略。