吉夢(mèng)夢(mèng) 孟祥平 馮小倩 徐欣欣 張玉清 秦 宇

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，洛陽(yáng) 471000)

HIV-1是反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬成員，它的基因組是雙正鏈 RNA，主要侵犯人體的CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。當(dāng)HIV-1進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其正鏈RNA開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA。HIV-1 反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程一般包括以下步驟：①負(fù)鏈強(qiáng)終止DNA(-sssDNA)的合成；②長(zhǎng)負(fù)鏈DNA的合成；③正鏈強(qiáng)終止DNA(+sssDNA)的合成；④完整的雙鏈DNA合成[1]。最后合成的完整DNA兩端含有LTR序列，又叫HIV-1晚期反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(HIV-1 late RT)，因此在檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程完整的 DNA雙鏈時(shí)，應(yīng)當(dāng)檢測(cè) LTR/Gag序列[2]。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程是HIV-1病毒復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已成為研發(fā)抗HIV-1藥物的重要靶點(diǎn)[3]。恒河猴TRIM5α屬于三重基序蛋白(tripartite motif protein，TRIM)大家族的成員，通過(guò)多種機(jī)制抑制HIV-1，而人的TRIM5α作用較弱[4-8]。將人TRIM5α中結(jié)合衣殼蛋白的B30.2(SPRY)結(jié)構(gòu)域用同樣結(jié)合衣殼蛋白的親環(huán)素A(CyPA)代替，構(gòu)建人源的hTRIMCyPA以避免異種蛋白的免疫排斥反應(yīng)。因此推測(cè)hTRIMCyPA也能特異識(shí)別并結(jié)合HIV-1衣殼蛋白，并影響衣殼蛋白的脫殼，抑制病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA[4-5]。雖然臨床有效的抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)提高了艾滋病的臨床療效，但因HIV-1的高度變異性和潛伏感染，存在藥物療效不佳和毒副作用大的問(wèn)題[9-10]。因此，本研究采用假病毒系統(tǒng)建立一種可分析感染細(xì)胞內(nèi)病毒生命周期早期特異性DNA 產(chǎn)物的相對(duì)熒光定量 PCR技術(shù)，并以其評(píng)價(jià)hTRIMCyPA對(duì)HIV-1的抑制作用。這對(duì)于未來(lái)抗HIV-1相關(guān)病毒新藥的研發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1材料 蛋白酶K、DNase Ⅰ購(gòu)自Sigma公司；SYBR Green Master Mix(Low Rox)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；EZTrans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海李記生物；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；兔抗GFP和內(nèi)參GAPDH多克隆抗體購(gòu)自上海生工生物公司；hTRIMCyPA基因表達(dá)質(zhì)粒hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，pNL4-3LucR-E-由徐建青教授惠贈(zèng)，HEK293細(xì)胞、HEK293t細(xì)胞、pMD2.G、pcDNA3.1和pcDNA3.1EGFP載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 引物由premier5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物公司合成。HIV-1晚期反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因引物的設(shè)計(jì)：參考 pNL4-3LucR-E-的序列，選擇HIV-1的LTR區(qū)和HIV-1Gag之間的序列設(shè)計(jì)晚期反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物引物，設(shè)計(jì)合成引物如下：LTRGag F：5′-TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT-3′，R：5′-GAGTCCTGCGTCGAGAGATC-3′。作為內(nèi)參基因的GAPDH基因引物如下：GAPDH F：5′-CAAGGCTGTGGGCAAGGTC-3′，R：5′-TGGAGGAGTGGGTGTCGCT-3′。

1.2.2HIV-1假病毒包裝 在包裝的前一天進(jìn)行鋪板，待HEK293T細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%匯合度時(shí)，將質(zhì)粒pMD2.G和pNL4-3LucR-E-以1∶3的比例聯(lián)合轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染按照 EZTrans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。轉(zhuǎn)染6 h后換液，48 h和72 h各收集全部上清，800 g離心5 min以去除細(xì)胞碎片，用0.45 μm的濾器過(guò)濾，分裝后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3hTRIMCyPA的表達(dá)及Western blot鑒定 將hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP及pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，第二天在熒光顯微鏡下觀察hTRIMCyPA的表達(dá)，48 h后，吸去培養(yǎng)液，用1 ml預(yù)冷的PBS洗1次，吸去 PBS，再用碧云天的IP及Western細(xì)胞裂解液(含1 mmol/L PMSF)裂解并收獲細(xì)胞，蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉后，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入Anti-EGFP 及內(nèi)參GAPDH多抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入偶聯(lián)HRP的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，洗膜后進(jìn)行ECL顯色。

1.2.4假病毒感染實(shí)驗(yàn) 將1.2.3轉(zhuǎn)染hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP及pcDNA3.1的細(xì)胞作為感染靶細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染前棄去培養(yǎng)基，每孔加入500 μl含2 ng p24 的假病毒，假病毒事先在37℃下10 mmol/L MgCl2中的用DNase Ⅰ(20 U/ml)預(yù)處理病毒1 h以除去殘存的質(zhì)粒DNA。為提高感染效率，加入1 μg/ml的polybrene。6 h后，用PBS洗3次以去除殘留未感染的假病毒。再繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性以確認(rèn)是否感染成功。

1.2.5細(xì)胞中總DNA的提取1.2.4操作至用 PBS 洗3 次去除殘留未感染的假病毒后，在24孔板中直接加入600 μl細(xì)胞裂解液(1.5 mmol/L pH8.0 Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.45%Np-40，0.45%Tween20)充分裂解，混勻后加入蛋白酶K(終濃度為100 μg/ml)，55℃過(guò)夜或57℃ 3 h，95℃15 min水浴滅活蛋白酶K，4℃，12 000 g 離心5 min取上清作為待測(cè)樣品。

1.2.6SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法建立 按照SYBR Green Ⅰ熒光PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，20 μl反應(yīng)體系：2×SYBR Green Ⅰ Mixture 10.0 μl，10 μmol/L Forward Primer 0.4 μl，10 μmol/L Reverse Primer 0.4 μl，Template DNA 1 μl，加ddH2O至20 μl。循環(huán)條件：95℃ 5 min；95℃ 10 s；58℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；58℃ 1 min退火階段采集熒光信號(hào)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取hTRIMCyPA組所提取的基因組DNA進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)梯度，分別用內(nèi)參引物和目的基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。儀器自動(dòng)繪制出對(duì)應(yīng)于內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有試驗(yàn)樣品均設(shè)3次重復(fù)。采用 2-ΔΔCt計(jì)算HIV-1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量，用內(nèi)參基因校準(zhǔn)目的基因表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1hTRIMCyPA的表達(dá)及Western blot鑒定 將hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP和pcDNA3.1空載體質(zhì)粒用EZTrans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。第二天用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hTRIMCyPA孔出現(xiàn)明顯的綠色熒光(見(jiàn)圖1B)，而對(duì)照孔沒(méi)有綠色熒光表達(dá)(見(jiàn)圖1A)。hTRIMCyPA與載體中的EGFP融合，因此可以判斷hTRIMCyPA表達(dá)成功。為進(jìn)一步確定該蛋白的表達(dá)，將hTRIMCyPA/pcDNA3.1EGFP或pcDNA3.1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，由于hTRIMCyPA與EGFP融合，因而hTRIMCyPA對(duì)應(yīng)的孔出現(xiàn)條帶而空載體組及空白細(xì)胞對(duì)照組均沒(méi)有條帶(見(jiàn)圖2)，進(jìn)一步說(shuō)明hTRIMCyPA成功表達(dá)。

圖1 hTRIMCyPA表達(dá)的熒光顯微鏡檢測(cè)

圖2 hTRIMCyPA的Western blot鑒定圖

2.2假病毒感染 熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后2組的熒光素酶活性明顯高于空白細(xì)胞對(duì)照組。hTRIMCyPA組的熒光素酶活性低于空載體組轉(zhuǎn)染組(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明HIV-1 假病毒顆粒感染成功，并且hTRIMCyPA具有抑制HIV-1的作用。

圖3 假病毒感染HEK293細(xì)胞后的熒光素酶活性分析

2.3熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立 在QuantStu-dio 3 型熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀上結(jié)束擴(kuò)增后，由系統(tǒng)軟件分析，以初始模板的對(duì)數(shù)為x軸，以Ct值為y軸作回歸曲線，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中HIV-1 late RT標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖4A)的相關(guān)系數(shù)R2為0.992 9。斜率為-3.381，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-3.381x+27.208。內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖4B)相關(guān)系數(shù)R2為0.993 7。斜率為-3.289，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-3.289x+25.307。二者的斜率相差低于0.1，表明二者擴(kuò)增效率一致，可用于接下來(lái)的相對(duì)定量分析。相關(guān)系數(shù)R2>0.99，表明兩標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，能夠準(zhǔn)確定量。

圖4 HIV-1 late RT 和 GAPDH 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4各樣品相對(duì)定量分析結(jié)果 利用本試驗(yàn)建立的SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR方法對(duì)假病毒感染的hTRIMCyPA表達(dá)的樣本組的抑制效果見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)hTRIMCyPA組HIV-1相對(duì)late RT量明顯少于空載體組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 HIV-1假病毒感染后各組HIV-1 late RT產(chǎn)物的相對(duì)量

3 討論

熒光定量PCR克服了常規(guī) PCR 只能定性不能定量的技術(shù)難題，其包括絕對(duì)和相對(duì)兩種定量方法。絕對(duì)定量法需要克隆相關(guān)的基因以構(gòu)建相應(yīng)表達(dá)載體作為標(biāo)準(zhǔn)品用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且每次試驗(yàn)均要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度。本研究以 SYBR GreenⅠ作為熒光標(biāo)記物，不需要設(shè)計(jì)昂貴的探針，因而成本相對(duì)較低。為了驗(yàn)證目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增的Ct值與拷貝數(shù)的相關(guān)性，本研究建立了各自標(biāo)準(zhǔn)曲線加以驗(yàn)證。在實(shí)時(shí)定量中，只要將待測(cè)樣品中的任何一個(gè)作為 “相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品”，系列稀釋后用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可獲得斜率并驗(yàn)證方法的可行性[11-12]。這無(wú)疑降低了實(shí)驗(yàn)的工作量和復(fù)雜性。

本研究所設(shè)計(jì)的HIV-1 late RT引物，上游處于LTR序列，下游處于Gag前端，擴(kuò)增出LTR/Gag序列代表連續(xù)完整的HIV-1序列。若把引物設(shè)計(jì)在Gag或Luc等部位，擴(kuò)增出來(lái)的片段不能夠代表完整片段，很可能包含一些中間片段，部分是中間合成的長(zhǎng)負(fù)鏈 DNA產(chǎn)物。本次研究也曾用Gag或Luc等部位設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其PCR產(chǎn)物的量明顯大于LTR/Gag引物擴(kuò)增的量，原因是這個(gè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物含有很多不完整片段，因而不能真正反映完整HIV-1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量，也不能代表HIV前病毒量[2,13]。據(jù)報(bào)道，ZACK等[14]利用 PCR檢測(cè)受激和靜息狀態(tài)人類(lèi)T淋巴細(xì)胞中 HIV-1的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程時(shí)，發(fā)現(xiàn)R/U5序列、U3序列和U3/R/U5-PBS之間序列所擴(kuò)增出的代表初始反轉(zhuǎn)錄片段產(chǎn)物數(shù)量幾乎相同，但受激T細(xì)胞中LTR和Gag之間擴(kuò)增出的代表完整 DNA片段數(shù)量明顯多于靜息細(xì)胞，所以選擇擴(kuò)增的LTR/Gag連續(xù)序列，能夠比較真實(shí)地反映HIV-1的反轉(zhuǎn)錄情況及病毒活性。

對(duì)于HIV-1DNA的提取一般參考基因組的提取方法，一般采用帶有DNA吸附柱的試劑盒提取或酚/氯仿抽提DNA法提取[15-16]。這2種方法一般要經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)管和離心沉淀，但是HIV-1轉(zhuǎn)錄后不會(huì)馬上整合到龐大而復(fù)雜的染色體上，有一部分最先還是些非整合的線形或環(huán)狀雙鏈DNA分子，通常稱為赫特(Hirt)DNA，因此有特定的提取方法[17-18]。在經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)管和離心沉淀后，這些散在的DNA可能并不一定和染色體基因組同比例的丟失，因而容易造成DNA得率較低以及實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。而直接用細(xì)胞裂解液處理后直接PCR在一定程度上能避免這個(gè)問(wèn)題，同時(shí)也降低了實(shí)驗(yàn)的工作量。目前直接PCR已經(jīng)在基因組的PCR擴(kuò)增中得到了廣泛的應(yīng)用，與用試劑盒提取以及其他方法相比，無(wú)論是擴(kuò)增質(zhì)量還是效率等都具有明顯的優(yōu)勢(shì)[19-20]。

本研究所用的pNL4-3LucR-E-HIV-1假病毒載體，因其基因序列中的膜蛋白基因被失活，需要與膜蛋白基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染才能包裝出子代假病毒，由此包裝的假病毒由于僅具有單次感染能力而十分安全；另外，由同一外源質(zhì)粒表達(dá)所提供的膜蛋白可產(chǎn)生均一的假病毒顆粒，因而實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性得到保證，這樣就避免了HIV-1活病毒反復(fù)傳代變異而導(dǎo)致的重復(fù)性差的問(wèn)題[21]。有研究報(bào)道，用假病毒來(lái)進(jìn)行藥物篩選與同時(shí)用活病毒篩選結(jié)果一致，從而大大提高了藥物篩選的通量和安全性[22-23]。利用本研究建立的方法已經(jīng)成功篩選了多個(gè)抗病毒藥，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究。因而本研究建立的測(cè)定HIV-1特異性反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的熒光定量PCR的方法具有簡(jiǎn)單、高效和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可用于抗病毒藥物機(jī)制研究和藥物篩選。

致謝：感謝河南科技大學(xué)大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院段萬(wàn)理、張克蘭和秦怡帆同學(xué)，河南科技大學(xué)大學(xué)醫(yī)學(xué)院馬甜和余馮同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的幫助。