王 斌 梁偉龍 林欽賢 康志英* 王其豐 郭長(zhǎng)達(dá)

1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏回族自治區(qū)隆德縣六盤(pán)山中藥資源開(kāi)發(fā)有限公司，寧夏 隆德 756300 3.安徽省亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800；

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[1]，主產(chǎn)于安徽、山東、河南、湖南、湖北、四川、重慶等地。牡丹皮中主含酚及其苷類(lèi)、單萜及其苷類(lèi)兩大類(lèi)，亦含有機(jī)酸、三萜、黃酮、香豆素、揮發(fā)油、多糖及微量元素等多種成分[2-7]。

灰色關(guān)聯(lián)分析法為灰色系統(tǒng)理論的重要組成部分，主要針對(duì)信息不完全、機(jī)制不明確的灰色系統(tǒng)，根據(jù)數(shù)據(jù)序列曲線的相似程度分析因子間的量化和序化，實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)的預(yù)測(cè)、決策等功能[8-11]，目前已在許多中藥研究中應(yīng)用，如基于灰色關(guān)聯(lián)分析方法評(píng)價(jià)甘肅產(chǎn)紅芪質(zhì)量[12]、牡丹皮不同采收期質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究[13]，采用灰色關(guān)聯(lián)度法綜合評(píng)價(jià)不同采收期的牡丹皮藥材質(zhì)量，取得了許多科技成果。為了客觀、全面地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以17個(gè)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材為研究對(duì)象，按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版方法測(cè)定浸出物和總灰分，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定其沒(méi)食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷含量，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法，建立灰色關(guān)聯(lián)度模型，為牡丹皮藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)、MX5型、XS-204型電子天平(Mettler Toledo)、DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、SXL-1208型程控式箱式電爐(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)

1.2 材料 沒(méi)食子酸(110831-201605，純度90.8%)、兒茶素(110877-201604，純度99.2%)、芍藥苷(110736-201539，純度96.4%)、丹皮酚(110708-201407，純度99.9%)和苯甲酸(100419-200301)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷(MUST-16021505，純度99.93%)和苯甲酰芍藥苷(MUST-16061803，純度99.28%)購(gòu)自成都曼斯特有限公司；HPLC級(jí)甲醇(Merck)和磷酸(阿拉丁)；其余試劑為分析純，超純水。牡丹皮藥材于2017年先后于安徽、山東、湖南、湖北、重慶、四川等牡丹皮藥材主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司康志英高級(jí)工程師鑒定為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地牡丹皮藥材來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 浸出物 按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部醇溶性浸出物測(cè)定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑。

2.2 總灰分 按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部總灰分測(cè)定法(通則2302)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 多成分含量測(cè)定[14]

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品沒(méi)食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇水分別制成每1 mL含沒(méi)食子酸0.5 μg、0.5 μg、15 μg、20 μg、20 μg、50 μg、50 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取牡丹皮藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密移取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm的濾膜，即得。

2.3.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)器為DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，258 nm(氧化芍藥苷)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，10%A→32%A；15～25 min，32%A→48%A；25～40 min，48%A→58%A)；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。在此條件下，取對(duì)照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣10 μL分析，HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、3、5、7、10、15 μL，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下分析，以對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄7個(gè)對(duì)照品峰面積，結(jié)果顯示7個(gè)成分的峰面積RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下分別于0、3、6、9、12、18、24 h進(jìn)樣分析，記錄7個(gè)成分的峰面積，結(jié)果顯示7個(gè)成分峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)定同一樣品粉末6份，按“2.3.2”方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示7個(gè)成分的含量RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的牡丹皮粉末約0.25 g，共6份，加入與7個(gè)成分等量的對(duì)照品，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (%)

2.4 各指標(biāo)成分含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地牡丹皮藥材樣品，分別按“2.1”、“2.2”、“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定浸出物、總灰分、以及沒(méi)食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 牡丹皮樣品9種指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果 (%，n=3)

2.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析法的建立

2.5.1 參考序列選擇 設(shè)有n個(gè)研究樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，組成評(píng)價(jià)單元序列，記為{Xik}(i=1，2，3……n；k=1，2，3……m；本研究中n=17，m=9)。為了統(tǒng)一藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用將低指標(biāo)高優(yōu)化的方法，本試驗(yàn)將總灰分進(jìn)行取倒數(shù)轉(zhuǎn)換，與沒(méi)食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷和浸出物指標(biāo)共同組成指標(biāo)矩陣。藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)統(tǒng)一后，將最優(yōu)參考序列的各指標(biāo)對(duì)應(yīng)n個(gè)不同產(chǎn)地樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值，記為{Xsk}=max(1≤i≤n){Xik}，最差參考序列的各指標(biāo)對(duì)應(yīng)n個(gè)不同產(chǎn)地樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值，記為{Xtk}=min(1≤i≤n){Xik}。

2.5.2 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 以平均值變換最為常用，見(jiàn)公式(1)。

(1)

式(1)中Yik為數(shù)據(jù)經(jīng)規(guī)格化處理后的數(shù)值，Xik為原始測(cè)定數(shù)值，Xk為第n個(gè)藥材樣品的第k個(gè)指標(biāo)的平均值。

2.5.3 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 分別按公式(2)和公式(3)計(jì)算相對(duì)于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。

(2)

式(2)中Δmin= min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|(i=1,2……n;k=1,2……m)

(3)

2.5.4 關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 相對(duì)于最優(yōu)參考序列、最差參考序列的關(guān)聯(lián)度分別按公式(4)、(5)計(jì)算得到。

(4)

(5)

2.5.5 相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 最佳評(píng)價(jià)單元是評(píng)價(jià)單元與最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)程度最大，同時(shí)與最差參考序列的關(guān)聯(lián)程度最小值，所以將評(píng)價(jià)單元序列同時(shí)相對(duì)于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的相對(duì)ri關(guān)聯(lián)度定義為公式(6)。

(6)

2.5.6 樣品數(shù)據(jù)集的建立 測(cè)定不同產(chǎn)地牡丹皮藥材中9種成分的含量，建立牡丹皮藥材質(zhì)量灰色模式識(shí)別數(shù)據(jù)集，見(jiàn)表4。

2.5.7 數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 將原始測(cè)定數(shù)值按公式(1)進(jìn)行數(shù)據(jù)規(guī)格化處理，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同產(chǎn)地牡丹皮藥材的原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理

表6 評(píng)價(jià)單元序列相對(duì)于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

表7 評(píng)價(jià)單元序列相對(duì)于最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.5.9 關(guān)聯(lián)度與相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 分別按公式(4)、(5)計(jì)算各評(píng)價(jià)單元相對(duì)于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)度ri(s)、ri(t)，按公式(6)計(jì)算出17個(gè)不同產(chǎn)地牡丹皮藥材樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri，并進(jìn)行質(zhì)量排序，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 牡丹皮藥材關(guān)聯(lián)度、相對(duì)關(guān)聯(lián)度及質(zhì)量排序

2.5.10 藥材質(zhì)量評(píng)價(jià) 相對(duì)關(guān)聯(lián)度ri越大，表明該產(chǎn)地牡丹皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)越高，ri排序結(jié)果可作為藥材質(zhì)量高低評(píng)價(jià)的依據(jù)。由表8可見(jiàn)，17個(gè)產(chǎn)地牡丹皮藥材樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.314～0.597之間，其中6個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度>0.50，5個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.45～0.50之間，6個(gè)產(chǎn)地樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度<0.45，表明不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量存在差異。山西運(yùn)城絳縣(S07)、山西運(yùn)城聞喜(S06)、安徽銅陵(S01)、安徽南陵(S09)和陜西商洛(S15)的相對(duì)關(guān)聯(lián)度分別為0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位，藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)優(yōu)。湖北恩施利川(S10)、重慶墊江(S17)、亳州十九里(S03)、亳州五馬(S04)、亳州華佗(S02)和山東菏澤(S05)的相對(duì)關(guān)聯(lián)度分別為0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位，藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)較差。

3 討論

3.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 在建立牡丹皮藥材多成分含量測(cè)定的過(guò)程中，曾對(duì)流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)選，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液等多種流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，甲醇-0.1%磷酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)基線平穩(wěn)，干擾較小，各指標(biāo)成分峰分離度良好，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為牡丹皮的流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.2 提取方式的選擇 本試驗(yàn)考察超聲提取、回流提取的提取方式，結(jié)果顯示，回流提取的芍藥苷和丹皮酚峰面積均高于超聲提取，且重復(fù)性結(jié)果優(yōu)于超聲提取。比較回流提取0.5 h、1 h、1.5 h，回流1 h和1.5 h含量相近，而芍藥苷峰面積略高于0.5 h，綜合考慮，確定牡丹皮供試液的提取方式為回流提取1 h。

3.3 粉末粒徑的選擇 本試驗(yàn)考察2號(hào)篩、3號(hào)篩、4號(hào)篩不同篩目的粉末粒徑，結(jié)果顯示，2號(hào)篩樣品丹皮酚的重復(fù)性較3號(hào)篩、4號(hào)篩的差。3號(hào)篩與4號(hào)篩樣品的重復(fù)性總體情況良好，兩者含量相近，其芍藥苷峰信號(hào)均高2號(hào)篩粉末樣品，綜合考慮，確定選擇牡丹皮粉末粒徑為3號(hào)篩。

3.4 定容溶劑的選擇 本試驗(yàn)在稀釋定容過(guò)程中考察0%～100%的甲醇溶液，結(jié)果顯示，0%～40%的甲醇溶液稀釋的色譜圖中色譜峰數(shù)量較少，而60%～100%的甲醇溶液稀釋的部分色譜峰的峰型較差，分離度低，部分色譜峰出現(xiàn)裂峰，而50%的甲醇溶液稀釋較為良好，色譜峰數(shù)量較多，信息量較大。綜合考慮，確定選用50%的甲醇溶液進(jìn)行稀釋定容。

3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)考察230 nm、258 nm、265 nm、274 nm、292 nm等檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果顯示，檢測(cè)波長(zhǎng)為258～292 nm，色譜峰數(shù)量減少，包括芍藥苷在內(nèi)的一些特征信息未表達(dá)出來(lái)；檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm時(shí)，基本上只有丹皮酚一個(gè)色譜峰，而檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm時(shí)，色譜圖的峰數(shù)目、信息量較大，綜合考慮，確定選擇230 nm為牡丹皮的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地牡丹皮藥材質(zhì)量存在差異。山西運(yùn)城產(chǎn)地牡丹皮藥材中兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷和浸出物含量明顯高于其他產(chǎn)地，說(shuō)明其藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)較高；安徽銅陵、南陵所產(chǎn)的牡丹皮藥材質(zhì)量排序第3、第4名，說(shuō)明其藥材品質(zhì)較優(yōu)，這也與安徽銅陵和南陵為牡丹皮的道地產(chǎn)區(qū)相吻合；湖北恩施、重慶墊江、亳州、山東菏澤產(chǎn)地牡丹皮樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度排名靠后，說(shuō)明其藥材質(zhì)量較差。

牡丹皮化學(xué)成分眾多，成分的多樣性致使其質(zhì)量很難控制，單一的指標(biāo)成分不能準(zhǔn)確反映牡丹皮的藥效和質(zhì)量，使其在分析評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量時(shí)損失信息量太多。本研究以相對(duì)關(guān)聯(lián)度為測(cè)度，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)分析法，建立一種牡丹皮藥材質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)的模型，客觀整體地反映牡丹皮藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為牡丹皮藥材的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路，也為牡丹皮資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。