彭 霜 陳凌云，3 李 江 查麗春 彭海燕 李 雷

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500；3.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

酒精性肝病(Alcoholic Live Disease,ALD)是由于長期大量飲酒或者短時間內(nèi)攝入大量酒精引起的疾病。酒精在代謝過程中的氧化應(yīng)急作用及炎癥反應(yīng)是引起酒精肝的主要因素[1]。肝臟是機(jī)體代謝酒精的主要器官，代謝量達(dá)到90%以上，酒精對肝臟的損傷在所有器官中最為明顯[1]。有研究表明，酒精性肝病發(fā)病與線粒體損傷、代謝過程中的氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞凋亡等有密切關(guān)系[1-2]。也有研究[3]表明，某些中藥成分對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，在改善肝臟功能[4]、調(diào)節(jié)乙醇代謝[5-6]、減輕氧化應(yīng)激損傷[7]、抗炎護(hù)肝[8]和細(xì)胞凋亡[9]等方面，有明顯的優(yōu)勢。

甘葛護(hù)肝膠囊處方來源于云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(昆明市中醫(yī)醫(yī)院)的經(jīng)驗(yàn)方，由青皮、木香、茯苓、人參、三七、橘皮、炒神曲、豬苓、干姜、白術(shù)、澤瀉、葛花、砂仁、白豆蔻、牡蠣、枸杞子、葛根、余甘子共18味藥組成，具有良好的解酒保肝功效[10]。處方中的君藥是葛花，主要含有黃酮類化合物，是處方中解酒的有效成分之一，方中人參、茯苓等藥材也有相應(yīng)的保肝護(hù)肝作用[11]。處方以傳統(tǒng)湯劑的形式應(yīng)用于臨床，不便于患者攜帶，服用等，為了促進(jìn)處方的應(yīng)用與推廣，規(guī)范用藥劑量，保證療效，將其制成甘葛護(hù)肝膠囊。

為了更好地控制其質(zhì)量，保證用藥安全，對所制甘葛護(hù)肝膠囊中的干姜、木香、砂仁、澤瀉、陳皮、青皮、白豆蔻進(jìn)行TLC鑒別，并對其主要成分葛根素進(jìn)行含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(AgiLent)；色譜柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技公司)；超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；凈水器：超純水系統(tǒng)(上海倍捷Biogen科技有限公司)。

1.2 試藥 甲醇、石油醚、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇均為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；環(huán)己烷、正丁醇、甲酸均為分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；甲苯(AR，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司)；水為哇哈哈純凈水。干姜對照藥材(批號：120942-201510)、木香對照藥材(批號：120921-201309)、砂仁對照藥材(批號：120985-201406)、澤瀉對照藥材(批號：121081-201406)、橙皮對照藥材(批號：121137-201606)、陳皮對照藥材(批號：120969-201510)、青皮對照藥材(批號：121155-201103)，白豆蔻對照藥材(批號：120926-201608)(中國食品藥品檢定研究院)，甘葛護(hù)肝膠囊(批號分別為：20171123，20171124，20171125)，均由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 干姜TLC鑒別 取本品粉末1 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取干姜對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取缺干姜的陰性粉末1g，同法制成陰性對照溶液。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液1 μL，陰性對照溶液和供試品溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(3∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[12]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性供試品無干擾。如圖1所示。

2.1.2 木香TLC鑒別 稱取粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取木香對照藥材0.5 g，同法制成對照溶液。再取缺木香的陰性粉末0.5 g，同法制成陰性對照溶液。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取藥材對照品溶液4 μL，供試品溶液和陰性對照溶液20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸(15∶8∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[13]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 砂仁TLC鑒別 取砂仁藥材，去殼，取種子團(tuán)粉末(通過三號篩)1 g，用70%乙醇潤濕粉末，加石油醚(60～90 ℃)5 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。另取本品粉末和缺砂仁的陰性粉末各1 g，同法制成供試品溶液和陰性對照溶液。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液3 μL，供試品溶液和陰性對照溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯(11∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至105 ℃斑點(diǎn)顯色清晰[14]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。結(jié)果如圖3所示。

2.1.4 澤瀉TLC鑒別 取本品粉末2 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液加于氧化招柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑為1 cm，干法裝柱)上，用乙酸乙酯10 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴 mL使溶解，作為供試品溶液。另取本品粉末和缺澤瀉的陰性粉末各2 g，同法制成供試品溶液和陰性對照溶液[15]。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液1 μL，供試品溶液和陰性對照溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(2∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。結(jié)果如圖4所示。

2.1.5 陳皮、青皮TLC鑒別 甘葛護(hù)肝方由葛根、余甘子、人參等十八味藥組成，本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究對處方中所有藥味的TLC鑒別均進(jìn)行了研究。且依據(jù)所查文獻(xiàn)，每味藥至少采用了兩種鑒別方法。結(jié)果表明，除了干姜、木香、砂仁、澤瀉、陳皮、青皮、白豆蔻外，其他幾味藥均未找到合適的鑒別方法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本品中可鑒別出陳皮、青皮的特征斑點(diǎn)，但該斑點(diǎn)存在陰性干擾。最終采用雙陰性的方法去除鑒別過程中的陰性干擾。

取本品粉末0.3 g，加甲醇10 mL加熱回流 20 min，濾過，取續(xù)濾液5 mL，濃縮至l mL，作為供試品溶液。取缺陳皮和青皮的陰性粉末、陳皮和青皮藥材粉末各0.3 g同法制成陰性對照溶液。另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品和陰性對照溶液各6 μL，對照藥材溶液和對照品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一用硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁甲醇試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視[16]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。結(jié)果如圖5所示。

2.1.6 白豆蔻TLC鑒別 取豆蔻仁粉末約5 g，置圓底燒瓶中，加水200 mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水至刻度3 mL，再加正已烷2～3 mL 連接回流冷凝管，加熱至微沸并保持2 h，放冷，分取正己烷液，通過鋪有無水硫酸鈉約1 g的漏斗濾過，濾液置5 mL量瓶中，揮發(fā)油測定器內(nèi)壁用正己烷少量洗滌，洗液加入同一量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，濾液作為對照藥材溶液。再取缺白豆蔻的陰性粉末和本品粉末同法制成陰性對照溶液和供試品溶液。按薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各3 μL、對照藥材溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(15∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，立即檢視[17]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。結(jié)果如圖6所示。

2.2 葛根素含量測定 葛根作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中最具代表性的解酒藥物之一，有解酒防醉、改善心腦血管循環(huán)[18-20]、鎮(zhèn)痛[21]、降低血糖[22]、抗肝臟毒性[23]、防止高血壓及動脈硬化[24]、提高機(jī)體免疫力及抗菌、抗病毒等多種藥理作用[25]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)異黃酮類化合物是葛根的主要成分，其中葛根素是葛根的特有成分，也是中藥葛根中的指標(biāo)性成分，葛根素可通過抑制β2內(nèi)啡肽的釋放來改善抗自由基和腦功能，降低脂質(zhì)過氧化對細(xì)胞的損害，對急性酒精中毒有保護(hù)作用[26]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)葛根具有解酒作用，能降低乙醇在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，酒前服用比酒后服用效果更佳[27-28]。本實(shí)驗(yàn)主要對甘葛護(hù)肝膠囊中的葛根素進(jìn)行含量測定，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

2.2.1 對照品溶液制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成0.035 mg/mL的葛根素對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品甘葛護(hù)肝膠囊內(nèi)容物約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲 30 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量搖勻，離心5 min，濾過，精密移取25 mL濾液揮干，殘?jiān)?0%乙醇5 mL溶解，離心 5 min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得[29]。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性 試驗(yàn)Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-水(23∶77)；檢測波長：250 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；上述色譜條件下，葛根素對照品與其他組分色譜峰分離度良好。色譜圖如圖7所示。

結(jié)果表明：供試品中葛根素的分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2015年版四部通則0512高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算均大于4000。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密稱取處方中除葛根外其他味藥的混合粉末約5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。精密吸取陰性對照溶液10 μL注入液相色譜儀，進(jìn)行測定，即得。結(jié)果顯示：陰性樣品的色譜圖中在與對照品相同保留時間位置上沒有吸收峰，說明用本法測定其含量專屬性較強(qiáng)、靈敏度高。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對照品溶液(0.106 mg/mL)1、2、3、4、5、10 μL，注入液相色譜儀照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，葛根素的回歸方程Y=398.64X-1.0279，r=1，結(jié)果表明，葛根素在0.106～1.06 μg之間，峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一葛根素對照品溶液進(jìn)行測定，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得葛根素峰面積RSD值為0.21%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 對照品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取葛根素對照品，加30%乙醇制成0.035 mg/mL葛根素對照品溶液。精密吸取葛根素對照品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣量10 μL，測得葛根素峰面積RSD值為0.25%(n=6)，結(jié)果表明葛根素對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取甘葛護(hù)肝膠囊粉末約5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，制成供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣量10 μL，測得甘葛護(hù)肝膠囊供試品RSD值為1.54%(n=6)，結(jié)果表明甘葛護(hù)肝膠囊供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)精密 稱取20171123批次的甘葛護(hù)肝膠囊粉末6份，每份約5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份甘葛護(hù)肝膠囊供試品溶液，進(jìn)行測定，進(jìn)樣量10 μL，6份供試品溶液葛根素含量RSD為0.63%(n=6)，結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn)取 20171123批次的肝葛護(hù)肝膠囊粉末6份，每份約2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，按供試品制備方法制供試品溶液，精密加入葛根素對照品，制成供試品，取10 μL注入液相色譜儀測定含量，用公式：加樣回收率(%)=(實(shí)際測得量-樣品含量)/加入量×100%。計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表7。結(jié)果平均加樣回收率為99.92%，RSD 為1.76%。見表2。

表2 供試品加樣回收率實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果 (n=6)

2.2.11 樣品含量測定 分別稱取3個批次的甘葛護(hù)肝膠囊粉末，每個樣品取3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，測得甘葛護(hù)肝膠囊中葛根素的平均含量為0.0766 mg/g，每粒以0.5 g計(jì)，每粒含葛根素0.0383 mg。測定結(jié)果見表3。

表3 藥品含量測定結(jié)果

3 討論

甘葛護(hù)肝方由葛根、余甘子、人參等十八味藥組成，本研究采用醇水雙提分組方案進(jìn)行提取。其中，葛花、木香等四味藥采用醇提，醇提的藥渣與葛根、茯苓、枸杞子等10味藥材合并后再進(jìn)行水提，合并提取液制成稠浸膏。由于處方含有效成分在高溫下不穩(wěn)定的藥味，本試驗(yàn)將方中人參、三七、白豆蔻、炒神曲以生藥粉的形式加入稠浸膏中混勻、干燥、粉碎，制成膠囊。因所用生藥粉為極細(xì)粉，再進(jìn)行顯微鑒別時生藥粉中的特征性結(jié)構(gòu)已被破壞，故本試驗(yàn)并未進(jìn)行相關(guān)研究。

本研究對處方中所有藥味的TLC鑒別均進(jìn)行了研究。其中三七和人參所含有效成分相近，在鑒別中干擾較多，分離較難，所以未能建立此二藥的薄層鑒別方法。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，對剩余藥味至少采用了兩種方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明，除干姜、木香、砂仁、澤瀉、陳皮、青皮、白豆蔻外，其余味藥均未找到合適的鑒別方法。本品中可鑒別出陳皮、青皮的特征斑點(diǎn)，但該斑點(diǎn)在二藥鑒別中均存在陰性干擾，分析可能是此二味藥均含橙皮苷引起，后采用雙陰性的方法去除干擾，結(jié)果表明，此法可行。此法陽性結(jié)果僅可表明本品中含陳皮或青皮或者同時含陳皮和青皮，但亦可使處方的鑒別藥物數(shù)量達(dá)到處方藥量的1/3。

葛根素含量測定實(shí)驗(yàn)中，筆者首先對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，在甲醇-水(25∶75)的基礎(chǔ)上，對流動相比例進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示以甲醇-水(23∶77)為流動相時所得供試品色譜圖峰形良好。筆者也對供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，考察了供試品溶液制備中甘葛護(hù)肝膠囊內(nèi)容物的取樣量，分別取樣2.5 g，5.0 g，7.5 g，結(jié)果顯示，當(dāng)取樣量為5.0 g時，所得色譜圖中峰形較好。在此基礎(chǔ)上，也分別考察了當(dāng)超聲時間為20 min，30 min，40 min時對供試品溶液的影響，結(jié)果顯示，超聲時間30 min，所測得的含量與超聲40 min所測含量相近，確定超聲時間為30 min。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所建立含量測定方法重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度、精密度等均符合藥典規(guī)定，故將此方法用于甘葛護(hù)肝膠囊中葛根素的含量測定。