王婧華,楊寶軍,張芳

平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院病理科(河南平頂山 467000)

肺癌屬于一種起源于肺部支氣管黏膜或者腺體的惡性腫瘤，患者多伴隨著胸痛、喘鳴、咳嗽、咳血等臨床癥狀[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，我國肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，其中肺腺癌為肺癌的重要組成部分，其發(fā)病率呈現(xiàn)為逐步上升的趨勢。但目前臨床上對于肺腺癌的發(fā)生機制尚不完全明確，多采用手術(shù)、放化療等手段進行治療，但部分患者預(yù)后不良，5年生存率較低，因此尋找早期診斷肺腺癌的敏感指標(biāo)對改善患者預(yù)后具有重要的意義。腫瘤細胞免疫逃逸是目前臨床所研究的熱點，其中程序性死亡因子配體1(PD-L1)與腫瘤免疫逃逸相關(guān)[3]。CD8+T屬于T淋巴細胞亞群，參與機體免疫調(diào)節(jié)[4]。在本研究中，探討人肺腺癌PD-L1與腫瘤中CD8+T淋巴細胞的相關(guān)性，為臨床上肺腺癌的早期診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018年1月至2019年12月收治的肺腺癌患者80例，男45例，女35例，年齡46～70歲，平均(56.2±10.2)歲，41例有吸煙史，分化程度：低分化29例，中/高分化51例，28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期43例。本研究患者及其家屬均知情，簽署知情通知書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)診斷為肺腺癌，均未接受過放療、化療、免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤的患者；合并全身感染性疾病的患者；心、腎功能不全的患者；病歷資料不全患者。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 取所有肺腺癌患者手術(shù)切除癌組織及癌旁組織標(biāo)本，其中1/2組織標(biāo)本采用40 g/L的多聚甲醛進行固定，并進行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 μm，連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記。另外1/2標(biāo)本使用機械分離加酶消化聯(lián)合梯度離心法制備癌組織、癌旁組織單個核細胞懸液，待用。

1.2.2 PD-L1免疫組化檢測 將石蠟切片在二甲苯中重復(fù)脫蠟處理10 min，行梯度酒精水化，將蛋白酶修復(fù)液加入在溫度為37℃的恒溫冰箱中行孵化處理，孵化處理30 min，去除抗原修復(fù)液，將所制備的切片轉(zhuǎn)移至內(nèi)含3% H2O2的濕盒中，密封(去過氧化物酶封閉液)，在溫度為37℃的恒溫冰箱中行孵化處理，孵化處理10 min，使用PBS清洗。清洗完成后將山羊血清加入，在室溫下封閉處理，處理30 min，將封閉液吸處除(濾紙)，加入一抗，放入至適合后加入二抗，在室溫下孵育處理，處理1 h，運用PBS清洗，行DAB顯色處理10 min，采用梯度乙醇進行脫水，采用二甲苯?jīng)_洗片3次一直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。每份標(biāo)本在鏡頭下隨機選擇5個視野，所有病理切片均由2位以上經(jīng)驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法進行確診。

1.2.3 PD-L1蛋白表達量檢測 采用Western blot法檢測PD-L1表達。提取單個核細胞蛋白，BCA法定量分析，50 μg蛋白樣品上樣后做SDS-PAGE電泳處理，之后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，避光封閉1 h洗滌，將1∶1 000比例稀釋的PD-L1一抗稀釋溶液，4℃下過夜，洗滌，將1∶5 000比例稀釋的PD-L1二抗稀釋溶液加入，溫床孵育1 h后洗滌，發(fā)光液ECL加入，曝光3次，取重疊值。分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 CD8+T淋巴細胞含量檢測 采用四色熒光流式細胞儀檢測人肺腺癌組織和癌旁組織中CD8+T淋巴細胞含量，使用FCS Express V3流失分析軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1、CD8+T淋巴細胞在人肺腺癌組織和癌旁組織中的表達比較 肺腺癌組織中PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 PD-L1、CD8+T淋巴細胞在人肺腺癌組織和癌旁組織中的表達比較

注：A:癌旁組織；B:肺腺癌組織

2.2 PD-L1、CD8+T淋巴細胞與肺腺癌病理特征的關(guān)系 PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量在不同性別、年齡、吸煙史上對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量在不同分化程度、TNM、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期上對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ期肺腺癌組織中PD-L1蛋白表達量、CD8+T淋巴細胞含量高于中/高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ+Ⅱ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PD-L1、CD8+T淋巴細胞肺腺癌分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。見表2。

表2 PD-L1、CD8+T淋巴細胞與肺腺癌病理特征的關(guān)系

2.3 PD-L1、CD8+T淋巴細胞之間相關(guān)性分析 PD-L1、CD8+T淋巴細胞之間Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，PD-L1與CD8+T淋巴細胞水平呈正相關(guān)(r=0.344，P=0.002)。見圖2。

圖2 PD-L1、CD8+T淋巴細胞之間相關(guān)性

3 討論

近年來，隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重、吸煙人群的不斷增加，我國肺癌的發(fā)病率、病死率呈現(xiàn)為逐年升高趨勢，其中以肺腺癌類型為主[5]。在本研究中探討人肺腺癌PD-L1與腫瘤中CD8+T淋巴細胞的相關(guān)性，為臨床上肺腺癌的早期診治提供參考。

程序性死亡因子1(PD-1)屬于一種免疫細胞共抑制分子，為免疫球蛋白超家族成員，分子量為50～55 kD，在多種細胞表面上表達，包括NK細胞、活化B細胞、單核細胞、活化CD8+T細胞、活化CD4+T細胞、樹突狀細胞等，與自身免疫耐受性顯著相關(guān)[6-7]。PD-L1為PD-1配體，屬于一種負(fù)性共刺激分子，PD-L1位于9p24染色體中，對含有290個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白產(chǎn)生編碼作用[8-9]。當(dāng)PD-1與PD-L1產(chǎn)生結(jié)合作用后，在受到抗原受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，導(dǎo)致PD-1細胞質(zhì)去中兩個酪氨酸信號基序發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致其效應(yīng)T細胞凋亡或者失去其功能，最終實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[11]，PD-L1在多種細胞中廣泛表達，分子量為40 kD，因其受CD274基因編碼，在臨床上又被成為CD274，具有負(fù)性調(diào)控免疫反應(yīng)的作用。目前已有多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在肺癌中呈現(xiàn)為高表達，傅博等[12]在其研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1在肺腺癌組織中低表達，且與患者放化療預(yù)后相關(guān)；蘇寧等[13]在其研究中證實PD-L1在肺腺癌組織中低表達，且與患者EGFR基因狀態(tài)相關(guān)。在本研究中測定PD-L1在肺腺癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1在肺腺癌組織中高表達，且與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。

CD8+為T淋巴細胞亞群之一，在細胞毒性T淋巴細胞上表達，參與機體細胞免疫反應(yīng)，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中具有重要的意義[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，CD8+T淋巴細胞與多種細胞因子作用后可增強機體免疫功能，進而抑制惡性腫瘤進展。在肺癌組織中CD8+T淋巴細胞可促進IL-7大量產(chǎn)生，活化淋巴細胞因子所激活的殺傷細胞，從而發(fā)揮其腫瘤細胞殺傷功能，阻滯惡性腫瘤生長[17]。傅超等[18]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織CD8+T淋巴細胞與患者預(yù)后相關(guān)。貢鳴等[19]在其研究中發(fā)現(xiàn)，包括肺癌在內(nèi)的6種常見腫瘤患者在初始治療時均存在CD8+T淋巴細胞高表達現(xiàn)象，且其研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細胞的升高與患者免疫系統(tǒng)激活，可刺激并分泌期效應(yīng)細胞因子，進而產(chǎn)生較多的殺傷性淋巴細胞相關(guān)。在本研究中測定CD8+T淋巴細胞在肺腺癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD8+T淋巴細胞在肺腺癌組織中高表達，且與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。

臨床研究發(fā)現(xiàn)[20]，當(dāng)T細胞表面的PD-1與PD-L1相結(jié)合后，會招募蛋白酪氨酸磷酸酶1、蛋白酪氨酸磷酸酶2，作用于下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生阻滯信號，抑制CD4+T細胞增殖，促進CD8+T細胞增殖，進而發(fā)揮其抑制作用。在本研究中分析PD-L1、CD8+T淋巴細胞兩者之間關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1、CD8+T淋巴細胞兩者之間呈正相關(guān)，此結(jié)果說明，兩者可能共同作用，參與腫瘤免疫逃逸。

綜上所述，PD-L1、CD8+T淋巴細胞在肺腺癌組織中高表達，與患者疾病分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，且兩者呈正相關(guān)，共同參與此病的發(fā)展。