蔡衛(wèi)梅,李偉偉,陸志紅,楊留中

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科三病區(qū)(河南衛(wèi)輝 453100)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要類型之一，早期易被忽略，大多患者就診時(shí)進(jìn)展至中晚期，常采用姑息性治療，5年生存率<20%，預(yù)后較差[1]。而復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是NSCLC治療失敗的主要原因，因此研究復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制及預(yù)后的影響因素意義重大。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子9(Kruppel-like factor 9，KLF9)系基因調(diào)控因子，能通過轉(zhuǎn)錄激活域或轉(zhuǎn)錄抑制域與核定位信號(hào)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子功能，在黑色素瘤、胰腺癌中表達(dá)異常，并能調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4(transcription factor activating enhancer binding protein 4，TFAP4)是堿性螺旋環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用，其水平升高，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[4-5]。但現(xiàn)階段關(guān)于KLF9、TFAP4在NSCLC患者中與臨床病理特征關(guān)系的研究較少，對(duì)預(yù)后的影響仍不明確，本研究對(duì)此進(jìn)行探討，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2014年1月至2016年8月收治的NSCLC患者94例作為研究對(duì)象，均符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，入組時(shí)首次確診，可耐受活檢，無放化療等相關(guān)治療史，無肺結(jié)核，并同意配合隨訪，排除合并自身免疫疾病、存在認(rèn)知、精神障礙者。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑、儀器 Trizol總RNA抽提試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、DNA marker(上海生工生物工程公司)；PCR儀(美國ABI公司，7500)；恒溫振蕩器(太倉市科教器材廠)；高速離心肌(Heraeus公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；調(diào)速振蕩器(金華市富華儀器有限公司)。

1.2.2 檢測(cè)方法 入組者均于入院后治療前，活檢采集NSCLC組織標(biāo)本，放入液氮冷凍，標(biāo)本采集前均無NSCLC相關(guān)治療史。自液氮中取100 mg標(biāo)本，研缽中迅速研磨至粉末，加入1 mL Trizol試劑，并轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，反復(fù)吹打至充分溶解，室溫放置10 min。加入0.2 mL氯仿，低溫充分震蕩10 min，室溫放置5 min，12 000 r/min離心15 min，可見樣本分為3層，小心吸取上層水相至新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后室溫放置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入用0.1%DEPC水配的70%乙醇 1 mL，7 500 r/min離心5 min，上清棄去，倒扣EP管吸干水分，空氣干燥10 min。加入40 μL左右0.1% DEPC水溶解沉淀，吹打混勻，-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄前取2 μL總RNA溶液，采用紫外分光光度儀260與280 nm波長下測(cè)定OD值，以驗(yàn)證RNA純度與濃度，OD260/280介于1.80～2.00為符合要求。取總RNA溶液10 μL，加入1 μL Oligo(dT)(0.5 μg/μL)、1 μL RNase free ddH2O，65℃溫浴5 min，再冰浴30 s，加入5×Reaction Buffer 4 μL、M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL、dNTP Mix(10 mmol/L) 2 μL、RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，內(nèi)參β-actin上下游引物分別為5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′、5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′(205 kb)，KLF9上下游引物分別為5′-AGTACCGACCCATCCAGAC-3′、5′-GCCGTTCACCTGTATGCAC-3′(295 kb)，TFAP4上下游引物分別為5′-GCTGAGTCTCGGGGGTTAGT-3′、5′-GTGCCCTCTTTGCAACATTT-3′(128 kb)。反應(yīng)體系包括引物、4種dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液共20 μL，反應(yīng)條件，95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，60℃退火/延伸31 s，溶解曲線分析95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，共42個(gè)循環(huán)，以2-ΔΔCt表示檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較兩組年齡、性別、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤最大徑。(2)比較兩組癌組織中KLF9、TFAP4 mRNA表達(dá)量。(3)分析NSCLC預(yù)后的相關(guān)影響因素。(4)癌組織中KLF9、TFAP4 mRNA與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、腫瘤最大徑的相關(guān)性。(5)比較KLF9、TFAP4 mRNA高危者、低危者生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織KLF9、TFAP4 mRNA表達(dá)水平 癌組織KLF9 mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織，TFAP4 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織KLF9、TFAP4 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 不同KLF9 mRNA表達(dá)水平患者臨床病理特征 兩組年齡、性別、病理類型相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；KLF9 mRNA高表達(dá)組腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例、分化程度與低表達(dá)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同KLF9 mRNA表達(dá)水平患者臨床病理特征 例(%)

2.3 不同TFAP4 mRNA表達(dá)水平患者臨床病理特征 兩組年齡、性別、病理類型相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TFAP4 mRNA高表達(dá)組腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例、分化程度與低表達(dá)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同TFAP4 mRNA表達(dá)水平患者臨床病理特征 例(%)

2.4 癌組織中KLF9、TFAP4 mRNA與臨床病理特征的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析，KLF9 mRNA與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑呈負(fù)相關(guān)，與分化程度呈正相關(guān)，TFAP4 mRNA與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 癌組織中KLF9、TFAP4 mRNA與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 生存分析 隨訪期間，脫落5例。KLF9 mRNA、TFAP4 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.735、5.833，P=0.009、0.016)，見圖1、2。

圖1 KLF9 mRNA高、低表達(dá)患者生存曲線

圖2 TFAP4 mRNA高、低表達(dá)患者生存曲線

3 討論

NSCLC具有發(fā)病率高、預(yù)后差等特點(diǎn)。盡管現(xiàn)有診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但NSCLC患者生存率提高程度有限，因此研究NSCLC分子水平相關(guān)機(jī)制，為靶向性治療提供思路，對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

3.1 癌組織中KLF9基因表達(dá)及與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 KLF9羧基末端含有3個(gè)由高度保守的氨基酸組成的鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)內(nèi)部存在核定位信號(hào)，具有增強(qiáng)或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的作用，在機(jī)體重要器官發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡中扮演重要角色[7-8]。Kong等[9]研究顯示，KLF9在NSCLC組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，采用小RNA技術(shù)靶向KLF9，可影響癌細(xì)胞增殖和侵襲，提示KLF9與NSCLC臨床病理特征有關(guān)，可能會(huì)影響患者預(yù)后。本研究顯示，KLF9 mRNA高表達(dá)組腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例、腫瘤最大徑與低表達(dá)組相比，差異顯著，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑呈負(fù)相關(guān)，與分化程度呈正相關(guān)，提示KLF9 mRNA表達(dá)可影響NSCLC患者腫瘤分期、大小、轉(zhuǎn)移、分化程度，故與預(yù)后密切相關(guān)，上調(diào)KLF9 mRNA表達(dá)可能有助于患者臨床病理特征及預(yù)后的改善，為基因靶向治療提供了一個(gè)方向。郝登榮等[10]報(bào)道顯示，NSCLC組織中KLF9陽性率明顯低于癌旁組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者KLF9 mRNA水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者，本研究結(jié)論與之一致。KLF9影響預(yù)后的機(jī)制可能為：(1)KLF9能通過轉(zhuǎn)錄特異性結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶28的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶28表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。(2)KLF9能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[12]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，KLF9 mRNA高表達(dá)者生存曲線優(yōu)于低表達(dá)患者，直接佐證了KLF9 mRNA高表達(dá)有利于預(yù)后的改善。

3.2 癌組織中TFAP4基因表達(dá)及與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 TFAP4能識(shí)別并結(jié)合DNA[13]。Yang等[14]研究顯示，TFAP4在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，沉默TFAP4表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲與遷移，提示TFAP4與結(jié)直腸癌生物學(xué)行為有關(guān)，但在NSCLC中的報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，TFAP4 mRNA高表達(dá)組腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例、腫瘤最大徑與低表達(dá)組相比差異顯著，TFAP4 mRNA與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示抑制TFAP4 mRNA表達(dá)有助于改善患者臨床特征與預(yù)后。Wei等[15]報(bào)道顯示，與TFAP4低表達(dá)患者相比，TFAP4高表達(dá)結(jié)直腸癌患者的總生存時(shí)間顯著減少，是總生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素，支持本研究結(jié)論。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，TFAP4能調(diào)控上皮-間質(zhì)化過程多種基因表達(dá)，使細(xì)胞連接與極性喪失，為腫瘤細(xì)胞侵襲提供便利，且TFAP4參與細(xì)胞增殖的調(diào)控，在細(xì)胞分裂增殖的G2階段，TFAP4可導(dǎo)致染色體錯(cuò)聚和多極紡錘體，最終激活DNA損傷反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻斷被去除，細(xì)胞增殖持續(xù)進(jìn)行，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[16-17]。同時(shí)本研究顯示，TFAP4 mRNA低表達(dá)患者生存曲線優(yōu)于高表達(dá)者，直接證實(shí)TFAP4 mRNA低表達(dá)可改善預(yù)后。本研究不足之處在于，樣本量較小，且癌組織的獲取具有有創(chuàng)性，有待后續(xù)擴(kuò)大病例數(shù)，進(jìn)行驗(yàn)證、完善。

NSCLC患者癌組織中KLF9、TFAP4基因表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑、分化程度顯著相關(guān)，可影響患者預(yù)后，靶向KLF9、TFAP4基因可能有助于預(yù)后的改善。