楊國(guó)麗，王克才，王 軍，陳 峰，董素鳳，郝運(yùn)河，李曉娥，張繼一

（1．遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng)110000；2．山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟(jì)南250000；3．阜新市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 阜新123000）

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的一種豬的傳染病，臨床以體溫升高、關(guān)節(jié)膿腫、呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎和高死亡率為特征[1]，嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的健康。斷奶仔豬和保育階段的5～8周齡的豬易患病[2]，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%。此外，HPS還可引起敗血癥，在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。HPS屬革蘭氏陰性短小桿菌，其形態(tài)多變，有15個(gè)以上血清型[3]，其中血清型4、5、13最為常見（占70%以上）。該菌生長(zhǎng)時(shí)嚴(yán)格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），不需要X因子（血紅素或其他卟啉類物質(zhì)），在血液培養(yǎng)基和巧克力培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落小而透明，在血液培養(yǎng)基上無溶血現(xiàn)象；在葡萄球菌菌苔周圍生長(zhǎng)良好，形成衛(wèi)星現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，副豬嗜血桿菌病的真實(shí)發(fā)病率可能為實(shí)際確診的10倍之多[4]。

副豬嗜血桿菌與其他病毒，如豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)病毒、豬流感和豬呼吸道冠狀病毒[5-6]或細(xì)菌協(xié)同時(shí)比較容易引發(fā)動(dòng)物一些疾病[7-8]。近年來，從患肺炎的豬中分離出HPS的概率越來越高，與支原體肺炎的日趨流行有關(guān)，也與病毒性肺炎的日趨流行有關(guān)[9-10]。研究表明，副豬嗜血桿菌病在支原體感染豬肺中的檢出率可達(dá)51.2%[5]。針對(duì)副豬嗜血桿菌病防控通常的做法是采用藥物預(yù)防、治療及進(jìn)行免疫[11]。而針對(duì)該病的免疫目前面臨的主要問題是HPS對(duì)誘發(fā)疾病的免疫效果不清，誘發(fā)疾病免疫不佳。因此，文章進(jìn)行HPS防控中的免疫試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)在沈陽(yáng)博睿農(nóng)牧科技有限公司進(jìn)行。選取21日齡臨床健康保育仔豬共300頭，分成3組，每組100頭，分別為試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組。使用Trizol快速提取核酸DNA和/或RNA的方法，對(duì)采集的臨床樣品進(jìn)行核酸提取，用核酸檢測(cè)方法和測(cè)序分析，分離到該場(chǎng)的主要HPS血清型是1型和5型。

1.2 試驗(yàn)疫苗

針對(duì)性免疫疫苗使用嗜凈諾（副豬嗜血桿菌病二價(jià)滅活疫苗1型LC株+5型LZ株）購(gòu)自浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司（No.2017010）。肌肉注射3 mL/頭，3周后加強(qiáng)免疫1次。

副豬嗜血桿菌病滅活疫苗（4型JS株+5型ZJ株）疫苗購(gòu)自普萊柯生物工程股份有限公司（No.171009）。肌肉注射2 mL/頭，3周后加強(qiáng)免疫1次，試驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)HPS的發(fā)病率。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 生長(zhǎng)性能

記錄3組試驗(yàn)豬的初始窩重（21日齡）計(jì)算個(gè)體均重，記錄3組試驗(yàn)豬在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（70日齡）的窩重，計(jì)算總增重和個(gè)體平均增重情況。記錄3組試驗(yàn)豬試驗(yàn)初始至試驗(yàn)結(jié)束總消耗飼料情況，計(jì)算料重比。具體計(jì)算公式如下：

1.3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集臨床發(fā)病試驗(yàn)豬的肝、肺、脾、淋巴結(jié)等臟器樣品，接種于TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)，鏡檢。將純化的細(xì)菌接種于生化反應(yīng)鑒定管中，37℃過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用生物學(xué)卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)法，比較試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組在發(fā)病率、成活率、個(gè)體均重和飼料轉(zhuǎn)化方面的差異性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 副豬嗜血桿菌病針對(duì)性免疫同期對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果（見表1）

由表1可知，試驗(yàn)組的豬出現(xiàn)四肢腫脹、氣喘、咳嗽等癥狀的數(shù)量顯著少于對(duì)照組和空白組（P＜0.05）；保育結(jié)束后（70日齡），試驗(yàn)組的仔豬成活率及個(gè)體均重均顯著高于對(duì)照組和空白組（P＜0.05）；試驗(yàn)組的仔豬料重比顯著低于對(duì)照組和空白組（P＜0.05）；其他試驗(yàn)指標(biāo)未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

表1 副豬嗜血桿菌病針對(duì)性免疫同期對(duì)比試驗(yàn)Tab.1 Comparison of correspondingimmunizationschedulesfor Haemophilus parasuis

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果（見圖1、圖2、表2）

由圖1可知，菌落呈圓形、針尖狀、表面光滑透明隆起。由圖2可知，挑選形態(tài)較好的單一的菌落用革蘭氏染色法染色，鏡檢呈略彎曲短桿狀。

由表2可知，根據(jù)陰、陽(yáng)性結(jié)果結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，可初步綜合判定分離的細(xì)菌為副豬嗜血桿菌。

圖1 細(xì)菌培養(yǎng)Fig.1 Bacterial culture

圖2 染色鏡檢Fig.2 Gram staining microscopic examination

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果tab.2 Results of biochemical tests

2.3 免疫保護(hù)結(jié)果

同期免疫對(duì)比試驗(yàn)場(chǎng)，試驗(yàn)組的豬發(fā)病率5%，仔豬成活率94%，發(fā)病率比對(duì)照組和空白組分別降低9%和12%，成活率比對(duì)照組和空白組分別提高10%和13%。對(duì)照組和空白組的發(fā)病率和成活率差別很小。

3 討論

保證豬健康也是減少該病發(fā)生的基本前提。在開展本病針對(duì)性免疫試驗(yàn)過程中，還對(duì)其他引起呼吸道損傷的混合或繼發(fā)性常見疫病進(jìn)行了綜合防控，常見疫病造成的呼吸道損傷極易對(duì)HPS的繼發(fā)感染創(chuàng)造機(jī)會(huì)，從而加重HPS的流行[12]。因?yàn)镠PS是豬場(chǎng)常在菌，我國(guó)80%以上的規(guī)模豬場(chǎng)都存在該菌[13]。日常飼養(yǎng)管理中應(yīng)該防止其他疫病發(fā)生繼發(fā)感染HPS。因此，在HPS流行豬場(chǎng)，做好豬藍(lán)耳病、豬氣喘病、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病、豬鏈球菌病及各種寄生蟲等疾病的免疫和綜合防控是重中之重，合理防控可有效降低規(guī)模豬場(chǎng)養(yǎng)殖過程中的HPS感染和流行的風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。

4 結(jié)論

開展針對(duì)性同期對(duì)比試驗(yàn)具有顯著的防控效果，可減輕HPS病的發(fā)生率，提高生產(chǎn)性能。本研究使豬群的HPS發(fā)病率控制在6%以下，減少規(guī)模場(chǎng)HPS病的發(fā)生，提高保育仔豬的生長(zhǎng)性能和飼料轉(zhuǎn)化率，從而節(jié)省養(yǎng)殖成本。