周潔龍 程實(shí) 張余

微波消融(microwave ablation)可通過(guò)電磁波使生物體內(nèi)的極性分子(主要是水分子)反復(fù)快速摩擦產(chǎn)生高溫，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的滅活，目前廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療[1]。作為一種局部熱療技術(shù)，微波消融在2013年被寫(xiě)入肝癌治療臨床實(shí)踐指南，同時(shí)也應(yīng)用于肺癌和結(jié)直腸癌等的治療[2-4]。微波消融具有升溫速度快、瘤內(nèi)溫度高、凝固性壞死徹底和激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)等特點(diǎn)，與其他熱療技術(shù)相比，微波不受焦痂及干燥影響，對(duì)周邊血流影響較小，在滅活腫瘤組織的同時(shí)對(duì)周?chē)M織損傷較輕，因此特別適用于骨和肺等高阻抗(電阻大)臟器腫瘤的治療[5-6]。

微波消融不僅可通過(guò)熱效應(yīng)直接殺傷腫瘤，還可通過(guò)消融過(guò)程中腫瘤抗原和危險(xiǎn)信號(hào)分子的釋放誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)，使患者在腫瘤治療中獲益[7-10]。但是，目前對(duì)微波消融激發(fā)免疫反應(yīng)機(jī)制尚缺乏深入的研究。對(duì)微波治療腫瘤的免疫效應(yīng)的探究有利于微波消融在臨床中的應(yīng)用及推廣。在此對(duì)已有的微波消融治療腫瘤的免疫原性死亡機(jī)制及相關(guān)病理改變過(guò)程的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行綜述，并展望微波消融聯(lián)合免疫治療等方法在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。

一、微波消融誘導(dǎo)腫瘤免疫原性死亡

腫瘤的免疫原性死亡是指腫瘤在發(fā)生凋亡或者壞死的過(guò)程中通過(guò)釋放免疫原性分子如腫瘤抗原和危險(xiǎn)相關(guān)模式分子(danger-associated molecular patterns,DAMPS)等誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)[11]。微波消融通過(guò)產(chǎn)生高熱使腫瘤細(xì)胞壞死并釋放溶酶體酶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，組織發(fā)生缺血-再灌注損傷，產(chǎn)生并釋放鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)，增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原的攝取和處理，三磷酸腺苷(adenosine triphosphatase,ATP)招募和激活樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，高表達(dá)免疫原性分子如高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box1 protein,HMGB-1)結(jié)合樹(shù)突狀細(xì)胞Toll 樣受體4(toll-like receptor-4,TLR-4)并啟動(dòng)炎性反應(yīng)，熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)作為分子伴侶協(xié)助APC攝取腫瘤抗原并誘導(dǎo)APC成熟，激活腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL),誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生再一次腫瘤殺傷效應(yīng)[9,12-17]

二、采用微波消融治療腫瘤激活機(jī)體免疫效應(yīng)的病理過(guò)程

1.局部炎性反應(yīng)：微波消融造成的腫瘤局部高溫環(huán)境使腫瘤在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凝固性壞死，炎性細(xì)胞釋放一系列DAMPS，例如HSP，ATP和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)等，引起局部炎性反應(yīng)。有研究結(jié)果表明HSP與腫瘤抗原結(jié)合后形成復(fù)合物并釋放，被APC攝取后提呈給T細(xì)胞啟動(dòng)免疫效應(yīng)，例如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的極化[18-19]。此外，局部的炎性環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞因子如粒細(xì)胞集落刺激因子的釋放，也有助于促使T細(xì)胞和APC向腫瘤組織局部浸潤(rùn)，發(fā)揮免疫作用[20]。Yu等[7]采用大鼠皮下骨肉瘤模型進(jìn)行微波消融實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外周血中晚期炎癥指標(biāo)HMGB-1釋放增多，可作為新腫瘤抗原與TLR-4結(jié)合誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性反應(yīng)。此外，該研究者將經(jīng)微波消融后的K7M2骨肉瘤細(xì)胞或UMR106骨肉瘤細(xì)胞的上清液注射到裸鼠體內(nèi)，2周后皮下種植K7M2或UMR106骨肉瘤細(xì)胞，檢測(cè)外周血得到HMGB-1升高的結(jié)果。盡管微波消融升溫速度快，瘤內(nèi)溫度高，但由于消融持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短，腫瘤抗原暴露不充分，引起的局部炎性反應(yīng)及繼發(fā)反應(yīng)較為微弱[21-22]。以上研究結(jié)果表明，微波消融導(dǎo)致的凝固性壞死可引起局部炎性反應(yīng)，局部的炎性因子及炎性細(xì)胞可介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，但是其具體機(jī)制仍有待探究。

2．募集活化免疫效應(yīng)細(xì)胞：微波消融使腫瘤細(xì)胞在高溫下產(chǎn)生一系列病理變化，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，細(xì)胞器及蛋白質(zhì)變性失活暴露于細(xì)胞外環(huán)境中，被APC如DC識(shí)別并呈遞給局部募集的T細(xì)胞[23]。微波消融作為一種外界熱刺激，引起腫瘤細(xì)胞HSP-70表達(dá)增多，HSP-70與細(xì)胞內(nèi)多肽結(jié)合形成HSP-70-多肽抗原復(fù)合物，有效激活并在消融區(qū)域富集DC和腫瘤特異性T細(xì)胞，DC的成熟和活化與腫瘤細(xì)胞釋放HSP的含量直接相關(guān)[24]。有研究者對(duì)82例肝細(xì)胞癌患者采用經(jīng)皮微波消融治療癌腫結(jié)節(jié)，術(shù)后隨訪2～26個(gè)月，在消融及未消融區(qū)域的結(jié)節(jié)中，T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高，消融結(jié)節(jié)中升高更為明顯[8]。對(duì)病灶局部微波消融募集CD8+T細(xì)胞也有較多研究。Chen等[25]以10 W功率對(duì)C57BL/6J小鼠肝癌模型進(jìn)行癌灶微波消融，術(shù)后第10天提取小鼠脾細(xì)胞加入培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞被殺傷，CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯升高，提示抗腫瘤效應(yīng)可能主要來(lái)源于CD8+T細(xì)胞。有研究結(jié)果表明，采用微波消融殺傷腫瘤能夠募集T細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞等的抗腫瘤免疫效應(yīng)和抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移效應(yīng)[16,19,26]。Leuchte等[27]對(duì)23例肝癌患者接受微波消融治療后外周血T細(xì)胞與疾病結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)約30%患者經(jīng)微波消融治療后出現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，外周血中γ-干擾素(interferon-γ,IFNY-γ)及IL-5升高，且與患者長(zhǎng)期緩解及更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)，經(jīng)微波消融治療后腫瘤局部T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多。

3.激活抗腫瘤適應(yīng)性免疫：經(jīng)微波消融治療后發(fā)生壞死或者亞壞死的骨腫瘤細(xì)胞能夠活化特異性T細(xì)胞，例如CD4+和CD8+T細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，同時(shí)建立抗腫瘤記憶性免疫，控制局部腫瘤生長(zhǎng)及復(fù)發(fā)，減少腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[28]。對(duì)實(shí)體腫瘤進(jìn)行微波消融治療后，腫瘤細(xì)胞微觀表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂、蛋白質(zhì)等多種分子變性以及細(xì)胞骨架和代謝過(guò)程發(fā)生改變。諸多基因和分子水平的病理改變狀態(tài)被稱(chēng)為腫瘤變異負(fù)荷[29-30]。不同亞型的腫瘤抗原或突變多肽成為腫瘤微環(huán)境中適應(yīng)性免疫的起點(diǎn)，APC將不同的腫瘤抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞，不同類(lèi)型T細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，產(chǎn)生直接性抗腫瘤免疫或記憶性免疫應(yīng)答[31]。在進(jìn)行微波消融治療后，之前處于亞壞死狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞向壞死發(fā)展，不斷成為腫瘤新抗原或突變多肽的來(lái)源，記憶性淋巴細(xì)胞可多次分化、識(shí)別并產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。因此，保持并延長(zhǎng)記憶性淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性，對(duì)抑制載瘤患者的腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及改善遠(yuǎn)期生存質(zhì)量均有重大意義。

4.間接逆轉(zhuǎn)局部腫瘤免疫耐受：抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoy T cell,Treg)被認(rèn)為可逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫耐受。Treg分布在許多惡性腫瘤及周?chē)M織中，能夠調(diào)節(jié)CD8+或CD4+T細(xì)胞，導(dǎo)致抗腫瘤免疫效應(yīng)的減弱。關(guān)于Treg與卵巢癌、胃腸道惡性腫瘤和肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系已有較多研究，有臨床相關(guān)性研究和功能研究結(jié)果表明CD8+T細(xì)胞與Treg比值的升高與惡性腫瘤患者的預(yù)后不良和治療耐受相關(guān)，而且該項(xiàng)指標(biāo)對(duì)患者預(yù)后不良預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性高于單純的Treg數(shù)量值[4,32-33]。微波消融聯(lián)合免疫療法抑制Treg逆轉(zhuǎn)局部腫瘤免疫耐受的潛力有望改善日益增多的耐受免疫治療和化學(xué)治療的惡性腫瘤患者的現(xiàn)狀，但其具體機(jī)制仍需要深入的研究。骨肉瘤等高度惡性骨腫瘤患者的微波消融治療也是目前研究的重點(diǎn)方向。

三、腫瘤的微波消融聯(lián)合免疫治療研究現(xiàn)狀

1.臨床研究：已有臨床應(yīng)用微波消融聯(lián)合免疫治療提高患者抗腫瘤免疫功能的研究報(bào)道。過(guò)繼細(xì)胞免疫治療是指提取并分離自體或異體免疫細(xì)胞，在進(jìn)行體外修飾擴(kuò)增后輸注至腫瘤患者體內(nèi)以增強(qiáng)患者機(jī)體免疫功能[35]。有研究者通過(guò)將過(guò)繼細(xì)胞免疫治療與微波消融相結(jié)合實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)。Yu等[15]對(duì)29例肝癌患者分別行微波消融和微波消融聯(lián)合免疫治療，對(duì)聯(lián)合免疫治療組患者分別在微波消融術(shù)后第9天、12天、15天、1個(gè)月和3個(gè)月進(jìn)行雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)注射負(fù)載腫瘤裂解物的髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells，MDC)、腹腔注射樹(shù)突狀淋巴細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK)和靜脈注射細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells,CIK)，結(jié)果表明，聯(lián)合免疫治療組患者外周血?dú)訲細(xì)胞亞群的比值(CD3+/CD8+和CD8+CD28+/CD3+CD16+CD56+)升高，而負(fù)性調(diào)節(jié)和輔助性T細(xì)胞亞群(CD4+CD8+，CD4+和CD4+CD25+)比例下降。免疫檢查點(diǎn)是免疫反應(yīng)過(guò)程中具有抑制免疫反應(yīng)作用的位點(diǎn)，阻滯該位點(diǎn)可激活T細(xì)胞的活性[35]。Xie等[9]采用微波消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體(tremelimumab)治療16例晚期膽管癌患者，其中2例得到部分緩解，5例實(shí)現(xiàn)了疾病穩(wěn)定。微波消融聯(lián)合經(jīng)典免疫療法及免疫佐劑可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)，在腫瘤患者的臨床治療中具有重大意義，但聯(lián)合免疫治療藥物的應(yīng)用時(shí)機(jī)和劑量等序貫治療的策略需進(jìn)一步研究。

2.基礎(chǔ)研究：Zhu等[36]依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法將乳腺癌模型小鼠分為對(duì)照組、微波消融組、抗PD-1抗體聯(lián)合抗CTLA-4抗體組、微波消融聯(lián)合抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體組分別進(jìn)行處理，結(jié)果表明，微波消融聯(lián)合抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體組顯著延長(zhǎng)小鼠生存期，同時(shí)小鼠外周血和腫瘤組織中的CD8+T細(xì)胞數(shù)量以及血漿中IFN-γ濃度明顯升高；治療后再對(duì)4組小鼠分別注射等量的乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微波消融聯(lián)合抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體組明顯延遲了乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Li等[23]依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法將乳腺癌模型小鼠分為對(duì)照組、微波消融組、免疫激活劑OK-432組、微波消融聯(lián)合OK-432組，結(jié)果表明微波消融聯(lián)合OK-432組小鼠的生存期得到顯著延長(zhǎng)，腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加，消融后第25天對(duì)4組小鼠分別注射等量的乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微波消融聯(lián)合OK-432組中83%(5/6)小鼠完全排斥外源性腫瘤，而其他組小鼠均出現(xiàn)新發(fā)體積不等的腫瘤。Wu等[37]采用微波消融和微波消融聯(lián)合細(xì)胞因子緩釋微球(cytokine sustained-release microspheres，cytoMPS)對(duì)肝癌模型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明聯(lián)合治療組CD4+與CD8+的比例以及CTL細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)均明顯提高。Zhou等[38]聯(lián)合應(yīng)用微波消融與甘露糖碳點(diǎn)材料對(duì)小鼠肝癌模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)小鼠肝癌模型進(jìn)行微波消融處理后注入甘露糖碳點(diǎn)材料，能夠檢測(cè)到甘露糖碳點(diǎn)材料特異性攝取腫瘤相關(guān)抗原并呈遞給DC，產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)。腫瘤主動(dòng)特異性免疫治療(active specific immunotherapy,ASI)是采用經(jīng)過(guò)處理的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞裂解物制成疫苗，對(duì)腫瘤患者予以接種從而獲得免疫反應(yīng)[39]。Yu等[7]采用微波消融處理大鼠和小鼠的骨肉瘤細(xì)胞懸液，并取消融后的腫瘤細(xì)胞及上清液接種至大鼠和小鼠體內(nèi)，二次接種同種骨肉瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，血中IFN-γ和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)濃度升高并刺激CD8+T細(xì)胞生成，誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)抵抗骨肉瘤細(xì)胞的侵襲。建立并應(yīng)用不同的腫瘤動(dòng)物模型，可根據(jù)臨床需求對(duì)微波消融聯(lián)合不同免疫方法治療腫瘤的策略進(jìn)行深入研究，有利于治療方法在臨床中得到安全有效的推廣和應(yīng)用。

四、微波消融治療腫瘤存在的問(wèn)題與未來(lái)應(yīng)用的展望

1.存在的問(wèn)題：隨著微波消融在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，其免疫效應(yīng)逐漸被重視并得到深入研究。有研究者指出，在消融過(guò)程中將腫瘤細(xì)胞控制于中低溫狀態(tài)即可發(fā)生腫瘤細(xì)胞控制性壞死，這是微波消融激發(fā)免疫效應(yīng)的理想狀態(tài)，在這種狀態(tài)下部分腫瘤細(xì)胞即刻凋亡壞死，部分亞壞死狀態(tài)腫瘤細(xì)胞持續(xù)向壞死細(xì)胞轉(zhuǎn)歸，不斷釋放免疫原性分子，可產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的免疫效應(yīng)[40]。

然而，微波消融手術(shù)操作在微波功率、消融時(shí)間和溫度控制等方面尚缺乏統(tǒng)一量化的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致微波消融治療后腫瘤細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定，處于凋亡、壞死和亞壞死狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞比例不同，所釋放的腫瘤免疫原性抗原差異較大，因此所調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)程度不一，無(wú)法對(duì)治療方法逆轉(zhuǎn)局部腫瘤免疫耐受的能力進(jìn)行評(píng)估[12]。如果把熱療技術(shù)作為活化機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的單一治療方式，所引發(fā)的抗腫瘤效應(yīng)較弱[25,41]。不同種類(lèi)腫瘤的腫瘤負(fù)荷差異較大，經(jīng)過(guò)微波消融激發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)也無(wú)法得到準(zhǔn)確的評(píng)估[26]。盡管對(duì)微波消融聯(lián)合免疫療法如化學(xué)治療、免疫檢查點(diǎn)抑制和細(xì)胞因子治療等[42]臨床前實(shí)驗(yàn)建模的評(píng)估已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，但如何更好地聯(lián)合使用兩種療法實(shí)現(xiàn)消融后抗腫瘤免疫效應(yīng)最大化和持久化以及治療可能存在哪些不良反應(yīng)等問(wèn)題仍然需要進(jìn)一步研究。

2.未來(lái)應(yīng)用的展望：探索微波消融治療腫瘤激發(fā)機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)的免疫機(jī)制，聯(lián)合應(yīng)用微波消融與其他治療方法，如免疫治療等，有利于提高腫瘤患者的臨床治療效果和推動(dòng)微波消融在臨床治療中的規(guī)范應(yīng)用。微波消融屬于熱應(yīng)激，可引起與溫度變化相關(guān)的特異性分子變化。有研究結(jié)果表明，熱休克轉(zhuǎn)錄因子和熱休克蛋白均與腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有密切的聯(lián)系[43]。此外，盡管免疫治療如PD-1抑制劑的應(yīng)用在許多惡性腫瘤的治療中取得了一定效果，但只有20%～30%患者從中獲益[44]。隨著惡性腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率不斷升高，采用微波消融治療轉(zhuǎn)移瘤，聯(lián)合應(yīng)用微波消融和免疫療法增強(qiáng)免疫效應(yīng)治療轉(zhuǎn)移及原發(fā)腫瘤，有望使更多腫瘤患者獲益。

與其他外科治療手段相比，微波消融治療具有基于熱刺激的非熱效應(yīng)，可獲得基于局部治療的系統(tǒng)性反應(yīng)，在獲得良好的近期臨床治療效果的同時(shí)，其遠(yuǎn)期治療效果也應(yīng)得到更多關(guān)注。在未來(lái)的研究中，采用微波消融結(jié)合生物材料以及聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑等增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)的方法，殺傷原位腫瘤的同時(shí)對(duì)抗腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，將可能成為治療腫瘤特別是惡性轉(zhuǎn)移瘤的有效方法。微波消融激發(fā)的免疫效應(yīng)存在巨大的臨床應(yīng)用潛力，對(duì)其免疫效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制的探索有利于推動(dòng)微波消融及其聯(lián)合療法的臨床應(yīng)用。