齊月，劉彥彤，張航，趙增杰

痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變(painful diabetic periphe-ral neuropathy,PDPN)屬于糖尿病引起周圍神經(jīng)功能障礙、神經(jīng)電生理等指標(biāo)異常以及相關(guān)臨床癥狀的并發(fā)癥，1型糖尿病患病率大約占5%，2型糖尿病患病率大約占20%[1]。臨床上以自發(fā)性疼痛、接觸性疼痛、痛覺過敏等癥狀為主，嚴(yán)重影響患者睡眠、情緒等生活質(zhì)量。然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確，認(rèn)為與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、多元醇通路激活、代謝紊亂、糖基化終產(chǎn)物堆積等有關(guān)[2]。目前對于PDPN治療比較棘手，主要采取控制血糖、改善微循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化應(yīng)激、改善代謝、止痛等手段來緩解癥狀，而尚無有效方法來逆轉(zhuǎn)PDPN的進(jìn)展,因此其治療成為一大難題[3]。中藥復(fù)方木丹顆粒具有益氣活血、通絡(luò)止痛功效，是臨床上第一個治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效明確的創(chuàng)新性中成藥，充分發(fā)揮中醫(yī)藥多靶向、多途徑性作用，目前已經(jīng)寫入中醫(yī)治療PDPN臨床路徑之中[4]?，F(xiàn)觀察木丹顆粒是否通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮對PDPN調(diào)控作用的，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗動物：健康SPF級Wistar雄性大鼠90只，8周齡，平均體質(zhì)量(180.0±23.5)g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[合格證號：SCXK(遼)2013]，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心，室溫(21±3)℃，相對濕度(55～65)%，噪音<60 dB，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，每日光照12 h，通風(fēng)良好，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食水。(2)藥物與試劑：木丹顆粒(營口奧達(dá)制藥有限公司生產(chǎn))；甲鈷胺片(北京星昊醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司生產(chǎn)，采購于沈陽市皇姑區(qū)普祥生物試劑經(jīng)銷處)；PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司生產(chǎn))；PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗和二抗(湖北雪瑾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))。(3)儀器設(shè)備：血糖儀(美國強(qiáng)生)，Vonfrey儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Thermo-Fisher)，離心機(jī)(Thermo-Fisher)，電泳儀(biorad)，凝膠成像儀(biorad)，定量PCR儀(biorad)。

1.2 實(shí)驗方法 2018年11月—2019年4月在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗中心進(jìn)行實(shí)驗。

1.2.1 造模與分組：將雄性Wistar大鼠90只適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取12只為正常組(CON組)，其余78只大鼠進(jìn)行造模，正常組將等體積的0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液單次腹腔注射，造模大鼠按STZ 53 mg/kg一次性腹腔注射，繼續(xù)喂養(yǎng)72 h后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖>16.7 mmol/L者列為觀察對象，14日后測機(jī)械性痛閾及神經(jīng)傳導(dǎo)速度，明顯下降者為PDPN造模成功(在實(shí)驗過程中糖尿病造模失敗5只，PDPN造模失敗13只)。再根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將成模大鼠60只隨機(jī)分為5組：模型組(MOD)、木丹顆粒低劑量組(MD-L)、木丹顆粒中劑量組(MD-M)、木丹顆粒高劑量組(MD-H)、甲鈷胺組(JGA)，每組12只。

1.2.2 實(shí)驗給藥：大鼠灌胃給藥劑量參照《動物實(shí)驗方法學(xué)》[5]，按照成人每日中藥用量與體質(zhì)量折算系數(shù)的 6.25 倍計算藥量。木丹顆粒低劑量組劑量為1.615 g·kg-1·d-1，中劑量組劑量為3.231 g·kg-1·d-1，高劑量組劑量為6.462 g·kg-1·d-1，甲鈷胺組劑量為0.231 mg·kg-1·d-1，上述藥物均用蒸餾水配制，濃度保證大鼠灌胃體積為1 ml/100g，每次配制200 ml,放置在4℃保存；模型組和正常組按等容積蒸餾水灌胃。以上6組均從成模后開始每日固定時間灌胃給藥1次，連續(xù)8周實(shí)驗結(jié)束。實(shí)驗期間大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 體質(zhì)量及血糖測定：于給藥前及給藥后2 w、4 w、8 w稱大鼠體質(zhì)量，并采用強(qiáng)生血糖儀測定尾靜脈血糖，采血針淺刺大鼠尾部下1/3處尾部靜脈， 使血液充分滴入血糖試紙中，按照血糖儀顯示數(shù)值記錄血糖。

1.3.2 機(jī)械痛閾測定[6]：于給藥前及給藥后2 w、4 w、8 w采用標(biāo)準(zhǔn)化Vonfrey儀測定各組大鼠后足的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(MWT)：將大鼠置于金屬網(wǎng)架上的透明有機(jī)玻璃盒內(nèi)，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境至少15 min，待大鼠的梳理和探究等活動基本消失，安靜并出現(xiàn)洗臉、梳理毛發(fā)等活動后，用電子Vonfrey儀的探頭纖維垂直剌激大鼠后肢足底中部，以大鼠在刺激后出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)為陽性反應(yīng)，記錄此時的受力數(shù)值(g)；每只大鼠每側(cè)足底測量3次，每一次測量后，待大鼠適應(yīng)環(huán)境3～5 min后再次測量。因身體活動所引起的縮足反應(yīng)不記作陽性反應(yīng)。

1.3.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定[7]：于給藥前及給藥后2 w、4 w、8 w檢測大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定成仰臥位，分離大鼠坐骨神經(jīng)，將刺激電極一端放在坐骨神經(jīng)干，而另一端放在神經(jīng)干腓支起始處，記錄兩電極之間的距離D(mm)和動作電位，刺激強(qiáng)度由小到強(qiáng)，分別計算2個點(diǎn)刺激產(chǎn)生動作電位的潛伏期T1和T2(ms)，記錄測定的肌電圖，按照傳導(dǎo)速度計算公式為：V(m/s)=D(mm)/(T1-T2)(ms)，記錄結(jié)果。

1.3.4 大鼠PI3K和AKT基因、蛋白表達(dá)水平測定：于用藥后8 w末各組隨機(jī)取8只大鼠，用20%烏拉坦( 0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定俯臥位，迅速取大鼠脊髓組織1 cm×0.15 cm 和L2～5背根神經(jīng)節(jié)，置入液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱中。

1.3.4.1 PI3K和AKT基因表達(dá) (1)總RNA的提取:按照Trizol 法提取L4～5背根神經(jīng)節(jié)和脊髓總RNA。(2)cDNA 模板的制備:分別取RNA 1μg按照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋cDNA原液以作為cDNA工作液。(3)定量PCR: 以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，β-actin內(nèi)參照253 bp，G1: 5＇-GCCTCGCTGTCCACC TTCCA-3＇，G2:5＇-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3＇；PI3K 擴(kuò)增產(chǎn)物377 bp，上游引物: 5＇-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3＇，下游引物: 5＇-CAGTTGTTGGCAATCTTCTTC-3＇；Akt 擴(kuò)增產(chǎn)物121 bp，上游引物: 5＇-GGACAACCGCCATCCAGA CT-3＇，下游引物: 5＇-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3＇，采用 PE9600定量PCR儀進(jìn)行mRNA水平檢測。PCR反應(yīng)體系為20 μl，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，55℃ 30 s，45個循環(huán), 72℃延伸7 min。

1.3.4.2 PI3K和AKT蛋白水平 (1)提取組織蛋白：取凍存的L 2～3背根神經(jīng)節(jié)和脊髓組織，充分研碎，加入蛋白裂解液，再轉(zhuǎn)移到EP管，放置冰上；每5 min振蕩1次，振蕩6次，使組織充分裂解，收集懸液，12 000 r/min 4℃ 離心15 min，收集上清，轉(zhuǎn)移分裝到另一個EP管，保存在-80℃待用。(2)BCA法測定提取蛋白濃度：用蒸餾水稀釋蛋白樣品，取適量BCA試劑盒A液和B液，按50∶1混勻成工作液，將反應(yīng)后的蛋白溶液，加入到孔板中，振蕩30 s，測定吸光度，計算蛋白濃度，同時將樣品蛋白保存在-80℃待用。(3)Western blot：制備聚丙烯酰胺凝膠，取樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)孵育，4℃過夜，TTBS洗膜，加入二抗(1∶2 000)孵育1 h，蛋白質(zhì)免疫檢測，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑顯色，用凝膠成像儀掃描，以目的蛋白與β-actin的灰度比值作為內(nèi)參，分析并讀取蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量比較 與CON組比較,MOD組在給藥2 w、4 w、8 w后體質(zhì)量均明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MOD組比較,MD-L、MD-M、MD-H組大鼠在給藥2 w、4 w、8 w后體質(zhì)量均有不同程度增加,其中各組在給藥4 w、8 w后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-M、MD-H組大鼠在給藥2 w、4 w、8 w后體質(zhì)量有不同程度增加,其中MD-H組給藥4 w、8 w后體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MD-M組比較， MD-H組在給藥8 w后體質(zhì)量增加(P<0.05)；與MD-H組比較，JGA組在給藥4 w、8 w后體質(zhì)量下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠給藥前后血糖比較 與CON組比較,MOD組在給藥2 w、4 w、8 w后血糖均明顯升高(P<0.01)；與MOD組比較,同期MD-L、MD-M、MD-H組在給藥2 w、4 w、8 w后血糖不同程度降低,其中MD-H組在給藥4 w、8 w后具有顯著性差異(P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-M、MD-H組在給藥4 w、8 w后血糖有不同程度降低,其中MD-H組給藥4 w、8 w后血糖有差異(P<0.05或P<0.01)，與MD-M組大鼠比較,MD-H組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05),與MD-H組大鼠比較,JGA組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠給藥前后血糖比較

2.3 各組大鼠給藥前后機(jī)械痛閾比較 與CON組比較,MOD組給藥2 w、4 w、8 w后機(jī)械痛閾敏感性明顯下降(P<0.01)；與MOD組比較,同期MD-L、MD-M、MD-H組及JGA組在給藥2 w、4 w、8 w后機(jī)械痛閾敏感性均有不同程度升高,在4 w和8 w差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-H量組在給藥8 w后升高(P<0.05)，其余無差異(P>0.05)；與MD-M組比較,MD-H組在給藥8 w差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與MD-H組比較,JGA組在給藥4 w、8 w后無差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠給藥前后機(jī)械痛閾比較

2.4 各組大鼠給藥前后坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較 與CON組比較,同期MOD給藥2 w、4 w、8 w后坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度均明顯減慢(P<0.01)；與MOD組比較,同期MD-L、MD-M、MD-H組及JGA組在給藥2 w、4 w、8 w后坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度均有不同程度加快,其中MD-L組在給藥8 w后，MD-M、MD-H組及JGA組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05或P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-M、MD-H組及JGA組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05或P<0.01)；與MD-M組比較，同期MD-H組及JGA組在給藥2 w、4 w、8 w后無差異(P>0.05)；與MD-H組比較，同期JGA組在給藥2w、4w、8w后無差異(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠給藥前后坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較

2.5 各組大鼠PI3K和AKT基因的表達(dá)水平 給藥8周后，與CON組比較，MOD組PI3K和AKT mRNA 表達(dá)均降低(P<0.01)；與MOD組比較，MD-L、MD-M、MD-H組及JGA組PI3K和AKT mRNA 表達(dá)均有升高(P<0.05或P<0.01 )；與MD-L組比較,MD-M、MD-H組及JGA組PI3K和AKT mRNA 表達(dá)均升高(P<0.05或P<0.01)；與MD-M組比較，MD高劑量組及JGA組PI3K和AKT mRNA 表達(dá)均升高(P<0.05)；與MD-H組比較，JGA組PI3K和AKT mRNA 表達(dá)無差異(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠PI3K、AKI基因表達(dá)量比較

2.6 各組大鼠PI3K/AKT蛋白水平比較 與CON組比較，MOD組PI3K、AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與MOD組比較，MD-M、MD-H組及JGA組均明顯增高(P<0.01 或P<0.05)，見圖1。

注：A.CON組；B.MOD組；C.JGA組;D.MD-L組；E.MD-M組；F.MD-H組

3 討 論

目前，糖尿病發(fā)病率逐年升高，中國民眾患病率約10.9%，到2035年預(yù)計將增加到5.92億，可以累及心、腦、腎、血管、神經(jīng)等，已經(jīng)成為危害人體健康的世界性代謝疾病之一[8]。同時，糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的患病率也呈逐漸上升趨勢，其中痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變是臨床上最為常見的神經(jīng)并發(fā)癥之一，約有25%糖尿病患者會存在PDPN，主要表現(xiàn)為肢體或軀干灼熱痛、刺痛，甚至難治性疼痛，嚴(yán)重影響糖尿病患者生活和工作質(zhì)量。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對PDPN發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前PI3K/AKT信號通路在其發(fā)病過程的作用引起人們越來越多的關(guān)注。PI3K/AKT 信號通路是細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞和應(yīng)答的橋梁，激活后可以參與多個疾病的生理和病理過程[9]。PI3K/AKT 信號通路是胰島素重要的下游信號傳導(dǎo)途徑，胰島素發(fā)揮生物效應(yīng)離不開 PI3K/AKT 信號通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此PI3K/AKT 信號通路具有調(diào)節(jié)血糖的功能[10-11]。研究證實(shí)，PI3K/AKT 信號通路在糖尿病狀態(tài)下會受到抑制。本研究結(jié)果證實(shí)，MOD組大鼠處于持續(xù)高血糖狀態(tài)，PI3K和AKT表達(dá)量明顯降低，而木丹顆粒各組PI3K和AKT表達(dá)量升高，血糖也有所降低，在一定程度上提示木丹顆?？赡芡ㄟ^激活PI3K/AKT信號通路來降低PDPN大鼠血糖。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)控細(xì)胞周期的經(jīng)典通路之一，參與神經(jīng)元細(xì)胞生長、分化、增殖等一系列細(xì)胞功能，在細(xì)胞存活及凋亡中起著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路在糖尿病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演著各種重要角色[12]，被認(rèn)為是誘發(fā)和維持神經(jīng)性疼痛的關(guān)鍵因素[13]，該通路在糖尿病性神經(jīng)元中被抑制，如果此通路被激活，會減弱高血糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[14]，緩解神經(jīng)痛。本研究結(jié)果顯示，MOD組大鼠機(jī)械性痛閾和神經(jīng)傳導(dǎo)速度延長，而木丹顆粒各組大鼠痛閾提高、神經(jīng)傳導(dǎo)速度加快，由此說明PI3K/AKT信號通路激活在PDPN神經(jīng)電生理的改變上起到了一定作用。

對于PDPN，西醫(yī)治療除了控制血糖、改善微循環(huán)、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗抑郁外，并無理想藥物[15]，往往是治標(biāo)不治本，治療后極易復(fù)發(fā)。因此，單純依靠現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法存在局限性，應(yīng)充分發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢，中西醫(yī)結(jié)合治療是必要的。PDPN屬于中醫(yī)“消渴病痹癥”范疇，辨證多認(rèn)為由氣虛血瘀所致，而木丹顆粒是益氣活血、通絡(luò)止痛的代表性藥物。既往研究表明，木丹顆?？梢约涌焐窠?jīng)傳導(dǎo)速度，減少細(xì)胞凋亡，降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，改善糖脂代謝，改變血液流變學(xué)障礙等[16-20]。

本實(shí)驗應(yīng)用木丹顆粒干預(yù)PDPN大鼠模型，結(jié)果表明，與CON組比較，MOD組大鼠背根神經(jīng)節(jié)PI3K和AKT mRNA和蛋白表達(dá)均降低。說明MOD組PDPN大鼠PI3K/AKT信號通路被激活引起組織損傷。木丹顆粒干預(yù)后，明顯升高神經(jīng)組織PI3K和AKT mRNA含量，使PI3K和AKT蛋白表達(dá)升高，減輕神經(jīng)組織的炎性損傷，而且效果呈劑量相關(guān)性，隨著木丹顆粒的劑量增加而更明顯，木丹顆粒中、高劑量組與JGA組效果相當(dāng)。

總之，本研究通過木丹顆粒對痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠PI3K/AKT 信號通路的影響，推測木丹顆?？赡芡ㄟ^上調(diào) PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕胰島素抵抗，增加胰島素的敏感性，減少神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡，發(fā)揮緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

齊月：設(shè)計研究方案，論文撰寫；劉彥彤、張航：實(shí)施研究過程，資料搜集整理；趙增杰：進(jìn)行統(tǒng)計分析