賀國強

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌亞門（Pezizomycotina）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（MorchellaDill.Ex Pers.：Fr.），是一類珍稀野生的名貴食用菌。羊肚菌的馴化栽培吸引著大批蘑菇愛好者投身其中。目前羊肚菌室內(nèi)栽培和室外大田栽培模式均取得了一定成功，對于羊肚菌產(chǎn)業(yè)化具有重要意義[1-3]。自2012年我國羊肚菌進入了產(chǎn)業(yè)化時期，種植面積由最初的200hm2，迅速增長到了4667hm2左右。但羊肚菌屬于子囊菌，菌種易退化，加之其生理及遺傳研究基礎(chǔ)薄弱，造成了羊肚菌栽培的不穩(wěn)定性，無法穩(wěn)定盈利，限制著羊肚菌產(chǎn)業(yè)的健康和穩(wěn)定發(fā)展。

目前羊肚菌栽培的菌株普遍采用組織分離的方法獲得，但隨著組織分離、轉(zhuǎn)代次數(shù)的增加等因素影響，會導致菌株中的其中一種交配型基因逐漸減少或衰退，造成減產(chǎn)或無法出菇[4-5]。因此，建立羊肚菌的單孢雜交育種方法對于羊肚菌品種選育至關(guān)重要。不同于擔子菌的雜交育種通常以單孢之間拮抗線處的鎖狀聯(lián)合作為標記，屬于子囊菌的羊肚菌菌絲沒有明顯的鎖狀結(jié)合，需要另外特定的標記以確定是否雜交成功。真菌的交配型基因是控制性發(fā)育的1 個基因簇位點。子囊菌中通常含有2 種類型的交配型位點即Mat1-1 和Mat1-2，如果2 個交配型位點位于同1 個細胞核內(nèi)，即可在分子層面認定為同宗結(jié)合真菌；反之如果分布在不同的細胞核上，則被認定為異宗結(jié)合真菌，交配型位點的序列沒有同源性，但調(diào)節(jié)著近等的功能，位點兩側(cè)有保守的基因序列，因此稱為idiomphom[6-8]。近年來通過對交配型基因（Mat1-1或Mat1-2）的研究，認為目前已被馴化栽培的梯棱羊肚菌（M.importuna）和六妹羊肚菌為異宗結(jié)合真菌，梯棱羊肚菌的子囊孢子雖為多核體，但為同核體[9]。基因組數(shù)據(jù)也表明，梯棱羊肚菌的交配型基因是單拷貝基因[6，10-11]，可以直接將其作為1 種共顯性核型標記使用。

收集梯棱羊肚菌親本菌株（F0）的單孢群體（F1），利用顯微操作法分離獲得單孢菌株，并對F1單孢群體交配型進行測定，隨后對F1群體間進行實驗室條件下的隨機配對雜交，獲得Fx菌株，以期為羊肚菌育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株梯棱羊肚菌栽培菌株M-15、M-CY、M-HM（F0親本菌株）源自商業(yè)化栽培菌株和野生馴化菌株，保存于北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站食用菌實驗室。采用形態(tài)學特征結(jié)合ITS 序列分析確證是梯棱羊肚菌。利用自然彈射法收集羊肚菌的子囊孢子。

1.2 單孢分離及純化采用顯微操作技術(shù)分離羊肚菌單個子囊孢子。首先采用50%的無菌甘油溶液將孢子稀釋至100 萬個/mL，取50μL 涂布于無菌載玻片，將載玻片置于倒置相差顯微鏡；用拉針儀或手工制備挑針，將做好的毛細管挑針拿在操作手臂上，緩慢將挑針移動至顯微鏡視野內(nèi)，在視野下用毛細管挑針吸住分散的單個子囊孢子，抬針，將吸取的子囊孢子在無菌操作環(huán)境下轉(zhuǎn)移（小洗耳球吹出）至CYM 完全培養(yǎng)基（酵母粉2g/L、蛋白胨2g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.46g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，加無菌水至1L）平板，置于23℃避光培養(yǎng)，約36～48h 可見萌發(fā)形成的單菌落。肉眼觀察平皿內(nèi)菌絲，并使用顯微鏡進行觀察，若明顯由一個子囊孢子萌發(fā)形成輻射狀菌絲，基本可視為單孢菌株。無菌操作及時切取菌絲生長末端的單根菌絲，轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基內(nèi)，即獲得純化的單孢菌絲。單孢群體F1編號為F1（M）n，M 表示親本菌株名稱，n 為數(shù)字編號，代表第n 個單孢。

1.3 交配型基因的測定DNA 的提取中，F(xiàn)0親本菌株、F1單孢群體均為純培養(yǎng)的菌絲體。菌絲體或組織塊經(jīng)液氮研磨后，用裂解液（CTAB 2%、PVP 2%、Tris-HCl 100mmol/L、EDTA 20mmol/L、NaCl 1.4mol/L）裂解獲得DNA 粗提液，經(jīng)V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1 去蛋白后再經(jīng)乙醇沉淀、RNAase 消解去除RNA 污染，最終獲得純凈DNA，稀釋至50ng/μL，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

交配型基因的擴增引物為MAT1、MAT2[10]，P8-4、P6-1[12]，PLiu1、PLiu2。其中引物對MAT1F/R、P8-4F/P8-4R、PLiu1F/R 用于檢測交配型MAT1-1-1，引物對MAT2F/R、P6-1F/P6-1R、PLiu2F/R 用于檢測交配型MAT1-2-1。P8-4F 的核苷酸序列為5′-GCTCTCTTGTGCCCCTTTTGACTAT-3′，P8-4R 的核苷酸序列為5′-TCTACCAGCCATGTGAAAC AAGCAA-3′；P6-1F 的核苷酸序列為5′-GAGA CTCAAATCTGACTGACTTCCT-3′，P6-1R 的核苷酸序列為5′-GAAGAACCTCAGATAAGCGTAAAAT-3′。擴增的目的片段大小分別為1837bp 和1740bp，分別代表MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因序列全長。25μL 擴增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5μL，10μmol/L 的P8-4F、P8-4R 引物各1μL，DNA 模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR 擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30 個循環(huán)；72℃延伸10min。所有擴增產(chǎn)物在1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 F1 單孢群體菌絲生長特性測定直接用肉眼觀察菌落特征，主要包括菌絲生長整齊度、顏色、菌核數(shù)量。菌絲日均長速的測定：當菌絲體培養(yǎng)到第N 天（96h）時（以菌絲將近長滿平皿而未長滿平皿時作為測量終點），以接種塊為中心用刻度尺測量菌落直徑（mm），隨機測量4 次，取平均值。菌絲日均長速的計算方法：菌絲日均長速（mm/d）=Y（菌落直徑-8mm）÷2÷培養(yǎng)天數(shù)（d）。最后取5 個重復的平均值。

1.5 F1 單孢群體平皿內(nèi)融合按照Volk 等[13]的單孢融合方法，將基因型分別為MAT1-1-1和MAT1-2-1型的單孢分為一組。在90mm 直徑的PDA平板內(nèi)均分4 個區(qū)，分別從MAT1-1-1和MAT1-2-1型組單孢選出2 個單孢菌絲，不同交配型基因按對角線均等排列（為了減少平皿個數(shù)），菌絲塊圓柱體的直徑約0.5cm，菌絲塊之間的距離約為4cm。將接種好的各單孢子菌株繼續(xù)于25℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲體長至兩兩之間相互交匯，觀察現(xiàn)象并記錄。

1.6 雜交融合Fx 菌株的篩選、鑒定從菌絲交匯處隆起部位挑取0.2cm×0.2cm 接種于新的PDA平皿內(nèi)，25℃恒溫培養(yǎng)，然后檢測其交配型基因類型，若同時含有MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因，則可能是雜交融合子。將同時含有MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因的疑似融合菌株與相應的親本F1單孢菌株接種于同一個PDA 平皿內(nèi)，觀察其有無拮抗線，若疑似融合菌株與相應的親本F1單孢菌株兩兩間都有拮抗線存在，則表明雜交成功。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢分離及純化待單孢菌絲剛剛萌發(fā)時，挑取單根菌絲，接種于新的CYM 平板，編號，進行培養(yǎng)。共挑取399 個單孢，萌發(fā)獲得并純化得到141個單孢菌株，成功率35.34%。3 個親本菌株的F1單孢挑取成功率差別較大（表1），F(xiàn)1（M-CY）的單孢挑取成功率最低，僅為26.92%；F1（M-15）、F1（M-HM）的單孢挑取成功率較高，均達到40%以上，可能與各親本菌株的F1單孢的活力有關(guān)，從而直接影響了單孢的萌發(fā)率，進而影響了單孢挑取的成功率。

表1 顯微操作法挑取單孢的成功率統(tǒng)計

2.2 F1 單孢群體菌絲生理特性由表2 可知，同一親本獲得的單孢群體，在菌絲生長、產(chǎn)生色素方面存在差別。F1（M-15）有1 株單孢產(chǎn)黃褐色素，F(xiàn)1（M-CY）有3 株單孢產(chǎn)黃褐色素，F(xiàn)1（M-HM）無單孢產(chǎn)黃褐色素，但有17 株單孢產(chǎn)灰褐色素。綜合來看，不產(chǎn)色素的菌株最多，占比84.8%，產(chǎn)黃褐色素的菌株占比2.9%，產(chǎn)灰褐色素的菌株占比12.3%。

表2 基于PDA 上的培養(yǎng)特征的單孢菌株分組

由表3 可知，同一親本獲得的單孢群體，單孢的生長速率差別也很大。F1（M-CY）的最小生長速率值最小，為0.85cm/d，F(xiàn)1（M-HM）的最大生長速率值最大，為1.93cm/d，而3 個單孢菌株的平均生長速率相差不大，分別為1.49cm/d、1.46cm/d、1.53cm/d。

表3 單孢菌絲生長速率 （cm/d）

2.3 F1 單孢群體的分型不同引物對的特異性存在較大差別。由表4 可知，相比較使用MAT1F/R、MAT2F/R 引物對，利用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物對可以較好地擴增出MAT1-1-1、MAT1-2-1基因，用于區(qū)分出單孢的交配型基因類型，檢出率達87.5%，基本與使用PLiu1F/R、PLiu2F/R引物對結(jié)果一致，因此，采用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物對擴增交配型基因。

利用改進的特性引物（P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R）進行PCR 擴增，檢測單孢菌株的交配型基因。由表5 可知，共完成93 株單孢菌株的交配型基因分型，經(jīng)統(tǒng)計分析，MAT1-1-1與MAT1-2-1型單孢菌株數(shù)分別為37 株和51 株，比例為0.73∶1。其中F1（M-15）、F1（M-CY）、F1（M-HM）基因型為MAT1-1-1型的菌株數(shù)分別為15 株、14 株、8 株，基因型為MAT1-2-1型的菌株數(shù)分別為22 株、15 株、14 株。僅有F1（M-CY）中1 株菌株未檢測出交配型基因類型。F1（M-15）中4 株菌株同時檢測出兩種交配型基因類型，重復試驗結(jié)果依然如此，可能這4 株菌株為混合孢子，非單孢。

表4 不同引物對單孢菌株的交配型基因的檢出統(tǒng)計

表5 單孢菌株的交配型基因分型統(tǒng)計

2.4 單孢菌株間融合表現(xiàn)將已鑒定的不同交配型基因單孢菌株接種于同一平板，使菌絲接觸，發(fā)生融合。初步共完成配對408 個組合。挑取不同交配型基因單孢接觸的融合帶，接種于新的PDA 平板，待菌絲剛萌發(fā)，挑取單根菌絲。由表6 可以看出，菌株之間兩兩生長接觸，表現(xiàn)出3 種融合類型：（1）有融合帶（隆起），無色素；（2）有融合帶（隆起），產(chǎn)生褐色素；（3）無融合帶，兩菌株菌絲互相滲透生長。其中第2 種融合類型最多，占比43.4%，第3 種融合類型最少，占比僅為16.9%。

表6 不同交配型單孢菌株的平皿雜交統(tǒng)計

2.5 單孢融合菌株的鑒定將挑取的融合菌株，分別與母本進行拮抗試驗，與親本菌株都存在拮抗的菌株可能是雜交菌株。將與親本菌株都存在拮抗的融合帶菌株進行PCR，測序，鑒定交配型基因類型。鑒定出F1（M-CY）2×F1（M-15）8 同時含有MAT1-1-1型和MAT1-2-1型基因，為融合子。

3 結(jié)論與討論

采用顯微操作技術(shù)從3 株梯棱羊肚菌栽培菌株（F0）的子囊孢子群體（F1）中分離出單個孢子，進而獲得單孢菌株，并且單孢分離效率較高，達35.34%。顯微單孢分離技術(shù)尤其適合孢子較大的羊肚菌，單孢分離成功率較稀釋涂布法高。羊肚菌的子囊孢子較大，約十幾個微米，且識別度高，便于進行顯微操作。此外，相較于稀釋涂布法分離單孢，顯微操作在稀釋倍數(shù)合適的情況下，即每個視野內(nèi)2～3 個單孢，可以較好地排除兩個或多個子囊孢子的粘連（稀釋法易發(fā)生），確保分離得到的是單個孢子。F1單孢群體交配型基因分型結(jié)果表明，在隨機挑選的93 株單孢分離菌株中，交配型基因分型僅有4 株菌株同時檢測出兩種交配型基因類型，可能這4 株菌株為混合孢子，相較于一般的稀釋法（成功率小于30%）單孢挑取分離成功率很高。

F1單孢群體的菌絲生理特性研究表明，不同單孢的菌絲生長速率差別較大，最小的生長速率和最大的生長速率可相差1 倍。主要是由于子囊孢子是先經(jīng)過減數(shù)分裂，而后再進行一次有絲分裂形成的，基因出現(xiàn)了隨機組合，一個子囊內(nèi)的8 個子囊孢子有4 種基因型，而由于存在多個基因位點，理論上減數(shù)分裂得到的子囊孢子的基因型都不完全相同[14]。因此，分離到的單孢間可能存在差異，表現(xiàn)在菌絲生長速率、菌絲形態(tài)、產(chǎn)生色素等方面。

不同交配型基因擴增引物對的特異性存在較大差別。不同于Du 等[10]使用擴增引物MAT1F/R、MAT2F/R 對14 株黑色羊肚菌進行交配型基因的分型，本研究利用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物對可以擴增出MAT1-1-1、MAT1-2-1基因，較好地區(qū)分出單孢的交配型基因類型，檢出率達87.5%。這可能與引物與交配型基因的DNA 序列結(jié)合的特異性有關(guān)。

基于交配型基因的單孢分型，尤其適合于遺傳背景不完備、基因標記缺乏的子囊菌的遺傳標記。本研究中，不同交配型的F1單孢平皿配對試驗，成功篩選出1 個雜交子，為羊肚菌單孢雜交育種工作奠定了基礎(chǔ)。但在平皿內(nèi)進行單孢雜交，僅僅依靠交配型基因標記難度較大，如何判斷雜交融合成功、如何有效篩選是難點?，F(xiàn)有的基于拮抗反應和交配型基因的PCR 法，工作量大；而且基于交配型基因的融合觀察，存在拮抗的干擾；同時挑取融合帶中融合菌絲，存在親本菌絲的干擾，難度較大，效果依然不太理想。因此，需進一步研究有效的篩選標記以提高篩選效率。