邵 卓 王婭麗 劉 璐 溫小杰 劉 瑩 王友華

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2 沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，沈陽 113122）

傳統(tǒng)育種一般是通過對群體中大量個體進行性狀觀測來選育優(yōu)良后代，這一過程不僅操作繁瑣、耗費時間，而且效率低下。伴隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)在育種方面的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用而誕生的分子標(biāo)記輔助育種，可有效地解決這些問題[1]。分子標(biāo)記輔助育種是一項利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記，在雜交后代中精準(zhǔn)地對不同個體的基因型與表型進行關(guān)聯(lián)分析，進而輔助選擇的一種育種技術(shù)[2]。相比于傳統(tǒng)育種，分子標(biāo)記輔助育種不僅可以極大地縮短育種年限，提高育種效率，節(jié)約大量的人力、物力，且不受時間和環(huán)境限制，還可對不同階段及多種環(huán)境條件下（溫室、異地等）的樣本進行選擇。尤其是在隱性性狀（如抗?。⑦z傳力低的性狀（如產(chǎn)量、抗旱等）、多個抗性基因聚合的性狀以及表型鑒定困難且花費較高的性狀（如加工品質(zhì)等）選擇方面，分子標(biāo)記輔助育種比傳統(tǒng)育種具有顯著的優(yōu)越性[3-7]。在論文與專利雙維度視角下，對分子標(biāo)記輔助育種發(fā)展態(tài)勢進行分析，可以對其研發(fā)思路、技術(shù)創(chuàng)新和應(yīng)用方向等做出精準(zhǔn)定位。此外，基于多樣的論文和專利數(shù)據(jù)庫進行雙維度分析研究，是目前國家研發(fā)資源投放和有關(guān)部門進行戰(zhàn)略部署的重要依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源

本文關(guān)于分子標(biāo)記輔助育種的論文發(fā)表情況以科學(xué)引文索引數(shù)據(jù)庫擴展版（湯森路透集團Web of Science）作為數(shù)據(jù)源，以論文發(fā)表日作為采集數(shù)據(jù)的時間標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)更新時間截止到2019 年12 月25日。利用關(guān)鍵詞設(shè)計檢索式TS=“marker-assisted selection”or“marker assisted selection”or“markerassisted introgression”or“marker assisted introgression”or“marker-assisted breeding”or“marker assisted breeding”or“Marker-aided breeding”or“Marker aided breeding”or“Marker-aided selection”or“Marker aided selection”or“DNA-based marker breeding”or“DNA based marker selection”or“molecular-marker selection”or“molecular marker breeding”or“DNAmarker selection”or“DNA marker breeding”，文獻類型為Article，利用期刊篩選及人工判讀最終選取9201 篇論文作為本次分析的數(shù)據(jù)集。

分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域?qū)＠麛?shù)據(jù)來自商業(yè)數(shù)據(jù)庫智慧芽數(shù)據(jù)庫（PatSnap），以專利申請日作為采集數(shù)據(jù)的時間標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)更新時間截止到2019 年12 月25 日。檢索式同Web of Science 中的檢索式，通過國際專利分類（IPC，International patent classification）篩選和人工篩選，排除與分子標(biāo)記輔助育種無關(guān)的專利，最終得到14342 件專利。

最后，利用Origin 和Adobe Illustrator 對收集到的以上相關(guān)數(shù)據(jù)進行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記輔助育種論文及專利發(fā)展趨勢對2000-2019 年分子標(biāo)記輔助育種的論文發(fā)表量以及專利申請量進行分析（圖1）：論文發(fā)表量的整體趨勢表現(xiàn)為穩(wěn)定上升，其中2000-2015 年論文發(fā)表量呈持續(xù)上升態(tài)勢，并于2015 年達到最高值，2015-2017 年出現(xiàn)小幅度下降，2017-2019 年轉(zhuǎn)為回升勢頭；2000-2015 年專利申請量呈波動上升趨勢，2015-2017 年專利申請量急劇上升并在2017 年達到高峰，數(shù)據(jù)表明論文發(fā)表量和專利申請量增長趨勢基本一致，可見該技術(shù)的理論研究和實際應(yīng)用同步發(fā)展。

圖1 分子標(biāo)記輔助育種相關(guān)論文發(fā)表量和專利申請量的年度變化趨勢

2.2 重點技術(shù)領(lǐng)域分析分子標(biāo)記輔助育種論文涉及多個領(lǐng)域（表1），在前10 個領(lǐng)域中，涉及最多的為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，論文數(shù)量為5231 篇；其次是植物科學(xué)領(lǐng)域，論文數(shù)量為4271 篇；第三涉及的領(lǐng)域為遺傳學(xué)，論文數(shù)量為3335 篇；第四涉及的領(lǐng)域為生物技術(shù)應(yīng)用微生物學(xué)，論文數(shù)量為1086 篇；第五涉及的領(lǐng)域為生物化學(xué)與分子生物學(xué)，論文數(shù)量為770篇，這五大領(lǐng)域論文數(shù)量幾乎占總量的95%（為真實反映發(fā)表論文在各重點技術(shù)領(lǐng)域的分布情況，統(tǒng)計人員將單篇論文對應(yīng)多個技術(shù)領(lǐng)域的數(shù)據(jù)均納入統(tǒng)計）。除此之外，科學(xué)技術(shù)其他專題領(lǐng)域、獸醫(yī)科學(xué)領(lǐng)域、林業(yè)領(lǐng)域、海洋淡水生物領(lǐng)域以及生命科學(xué)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有涉及，但占比不高，這說明該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域聚焦于農(nóng)業(yè)育種與生產(chǎn)等方面。

表1 分子標(biāo)記輔助育種論文涉及的前10 個領(lǐng)域

表2 顯示了分子標(biāo)記輔助育種主IPC 小組專利申請情況，前10 位中，C12Q1、C12N15 和A01H5為核心技術(shù)，除此之外還有A01H1 和C12N5。其中主IPC 小組專利最多的IPC 分類號為C12Q1/68，有2972 項專利，其次為C12N15/11，有2112 項專利。C12Q1 所包括的2 個小組，即C12Q1/68 和C12Q1/6895，共有專利3889 項，分別涉及核酸領(lǐng)域和植物、真菌或藻類領(lǐng)域；C12N15 包括3 個小組，分別是C12N15/11、C12N15/82 和C12N15/09，共有4186 項專利，涉及DNA 或RNA 片段及其修飾領(lǐng)域、植物細(xì)胞領(lǐng)域和DNA 重組技術(shù)領(lǐng)域；A01H5 包括2 個小組，即A01H5/00 和A01H5/10，這一類別共有2172 項專利，涉及特征在于其植物部分的被子植物（有花植物）、除其植物學(xué)分類之外的被子植物領(lǐng)域和種籽領(lǐng)域；A01H1 包括2 個小組，A01H1/04和A01H1/02，共有1422 項專利，分別涉及的領(lǐng)域為選擇的方法和雜交的方法或設(shè)備；而C12N5 只有C12N5/10 1 個小組，這一類別擁有640 項專利，涉及的領(lǐng)域為經(jīng)引入外來遺傳物質(zhì)而修飾的細(xì)胞，如病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。從IPC 分布可以看出，目前DNA片段在植物細(xì)胞的重組、種籽創(chuàng)新和雜交育種選擇仍是分子標(biāo)記輔助育種研發(fā)的主體。

表2 分子標(biāo)記輔助育種專利前10 個重點技術(shù)領(lǐng)域分布

2.3 各國研發(fā)能力分析對論文發(fā)表量排名前10的國家進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示（圖2），中國的論文發(fā)表量為2763 篇，占排名前10 位國家論文發(fā)表總量的31%，居全球第一；美國的論文發(fā)表量為2344 篇，占排名前10位國家論文發(fā)表總量的27%，排名第二；印度、澳大利亞、日本和德國分別以756、539、502、491篇論文位列第三、四、五和六，表明中國近年來處于研究高產(chǎn)出狀態(tài)，與美國共同占全球58%的研發(fā)份額。

由圖3 可以看出論文發(fā)表前5 位的國家在2000-2019 年研發(fā)能力的發(fā)展趨勢：排名第一的中國論文發(fā)表數(shù)量總體呈現(xiàn)上升趨勢，2000-2007 年呈現(xiàn)平緩上升狀態(tài)，2007-2015 年連年快速上升，并在2010 年超越美國，成為論文發(fā)表數(shù)量最多的國家。緊隨其后的美國是起點最高的國家，在2000-2009 年是論文發(fā)表數(shù)量最多的國家，論文發(fā)表數(shù)量在波動中緩慢上升。印度的論文發(fā)表數(shù)量發(fā)展趨勢與美國類似，在2014 年超過澳大利亞，成為論文發(fā)表數(shù)量排名第三的國家。排名第四的澳大利亞論文發(fā)表數(shù)量時而上升時而下降，波動平緩，但總體變化量不大。排名第五的日本論文發(fā)表數(shù)量變化也比較平緩，且自2011 年開始有緩慢下降的趨勢。可見自2007 年之后，中國在該領(lǐng)域發(fā)展態(tài)勢強勁，論文發(fā)表數(shù)量在國際研發(fā)市場處于領(lǐng)先地位。

圖2 分子標(biāo)記輔助育種論文發(fā)表量排名前10 國家

圖3 論文發(fā)表量前5 位國家發(fā)文年際變化趨勢

同時，本文對全球?qū)＠暾埩颗琶?0 的國家進行統(tǒng)計，如圖4 所示：中國專利申請量為3068件，位居全球第一，在排名前10 國家的專利申請量中占比36%；美國緊隨其后，與中國的專利申請量不相上下，其申請量為3022 件，在排名前10 國家的專利申請量中占比35%；德國、瑞士和法國分別以727 件、346 件、262 件專利排名位于第三、四和五?？芍袊c美國在分子標(biāo)記輔助育種產(chǎn)業(yè)化方面并駕齊驅(qū)，成為該技術(shù)的主要技術(shù)創(chuàng)新與技術(shù)儲備國家。

圖4 分子標(biāo)記輔助育種專利申請數(shù)量排名前10 國家

圖5 展示了2000-2019 年專利申請量居于世界前5 位國家的專利申請趨勢。中國的專利申請量連年上升，且在2010 年超越美國，成為專利申請量最多的國家。排名第二的美國起點最高，在2010年之前一直處于領(lǐng)先地位，之后逐漸被中國反超，美國的專利申請趨勢波動幅度較大，但仍呈上升趨勢。排名位于第三的德國在2009 年達到高峰之后開始呈現(xiàn)波動下降趨勢。排名位于第四、第五的瑞士和法國，發(fā)展趨勢比較平緩，有小幅度波動。表明該技術(shù)在中美兩個農(nóng)業(yè)大國的市場前景廣闊，中美是目前全球分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)創(chuàng)新的主力軍。

圖5 專利申請量前5 位國家專利申請年際變化趨勢

其中，全球受理專利申請排名前10 位國家或地區(qū)專利局分別為中國、美國、世界知識產(chǎn)權(quán)組織、澳大利亞、歐洲專利局、西班牙、加拿大、日本、俄羅斯和印度。中國近年在國家項目的大力支持下，在分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用方面的研究發(fā)展迅猛。目前已在水稻、小麥、玉米、大豆和油菜等主要作物中鑒定了一批與關(guān)鍵性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，在選育后代的技術(shù)上取得一系列重大突破[8]。由圖6 可見，中國受理了3261 件專利，占前10 位受理地區(qū)專利受理總量的36%，與專利申請量趨平，表示中國分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的“引進來”與“走出去”相當(dāng)。美國在分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)創(chuàng)新上亦取得系列成果，其專利受理量為1403 件，占前10 位受理地區(qū)專利受理總量的16%，專利申請量比受理量高出19%，充分體現(xiàn)美國是分子標(biāo)記輔助育種的技術(shù)“輸出國”。作為全球?qū)＠季值闹匾獦屑~，世界知識產(chǎn)權(quán)組織在專利技術(shù)全球化應(yīng)用中起著重要作用，分子標(biāo)記輔助育種相關(guān)專利在世界知識產(chǎn)權(quán)組織的受理量為954 件，占前10 位受理地區(qū)專利受理總量的11%，反應(yīng)了該技術(shù)的國際共享度和活躍度。

圖6 排名前10 位專利受理地區(qū)受理量分析

2.4 論文發(fā)表與專利申請的研發(fā)機構(gòu)競爭力分析在發(fā)表關(guān)于分子標(biāo)記輔助育種的論文中，論文發(fā)表量排名前10 位的研發(fā)機構(gòu)均為高校和科研院所。根據(jù)圖7a 統(tǒng)計可知：高校的論文發(fā)表量為6462 篇，占發(fā)表總量的62%；其次為研究所，發(fā)表論文3787篇，占發(fā)表總量的36%；企業(yè)發(fā)表數(shù)量最少，為189篇，占發(fā)表總量的2%。通過論文發(fā)表量可知，理論研究的熱點機構(gòu)主要為高校與科研院所，亦是基礎(chǔ)研究的中堅力量。

在分子標(biāo)記輔助育種專利申請方面，由圖7b 可知：在排名靠前的機構(gòu)中企業(yè)數(shù)量最多，申請的專利數(shù)量為9698 件，在所有機構(gòu)中占比69%；其次是研究所，數(shù)量為3325 件，占比24%；高校專利申請數(shù)量最少，為1043 件，占比7%，同樣，在專利申請過程中各機構(gòu)之間也存在合作情況。通過專利申請量可知，企業(yè)主要側(cè)重保護知識產(chǎn)權(quán)用以開拓技術(shù)應(yīng)用市場。

圖7 論文發(fā)表機構(gòu)、專利申請機構(gòu)分布圖

將分子標(biāo)記輔助育種的論文發(fā)表量和專利申請量對比分析發(fā)現(xiàn)，代表基礎(chǔ)研究的高校、科研院所和代表技術(shù)創(chuàng)新應(yīng)用的企業(yè)在兩類知識產(chǎn)權(quán)產(chǎn)出方面有顯著差異。對論文發(fā)表量前10 名的研發(fā)單位統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其專利申請總量遠(yuǎn)低于論文發(fā)表總量（圖8）。其中，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局發(fā)表775篇論文，位于第一，無專利申請；排名第二的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)表540 篇論文，其專利申請量亦低于論文發(fā)表量。對專利申請量前10 名的研發(fā)單位統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其論文發(fā)表總量遠(yuǎn)低于專利申請總量，前6家研發(fā)機構(gòu)中，企業(yè)占4 家。其中，EPIGENOMICS AG 專利申請量位于第一，共申請922 件專利，但無論文發(fā)表；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)排名第二，申請量為439件，論文發(fā)表數(shù)量為230 篇，是該技術(shù)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和技術(shù)創(chuàng)新并舉的研發(fā)機構(gòu)；AJINOMOTO CO.，INC.排名第三，專利數(shù)量為332 件，同樣無論文發(fā)表。綜上，分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)研究主要由高校、科研院所推動，技術(shù)創(chuàng)新以企業(yè)為主導(dǎo)，部分高校、科研院所共同推進。其中，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在著力開展分子標(biāo)記輔助育種基礎(chǔ)研究的同時，驅(qū)動了技術(shù)創(chuàng)新，發(fā)表論文的同時兼顧了專利技術(shù)保護。

3 結(jié)論

3.1 分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域研發(fā)活動呈現(xiàn)活躍態(tài)勢利用易于鑒定的遺傳標(biāo)記特別是分子標(biāo)記進行輔助育種是提高選擇效率和降低育種不確定性的常用手段。分子標(biāo)記輔助育種經(jīng)過20 多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一項高效的現(xiàn)代分子育種技術(shù)，其優(yōu)越性必將對作物育種產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，并最終改變傳統(tǒng)育種模式[9]。由于這項技術(shù)的優(yōu)越性，使得該領(lǐng)域受到越來越多的重視，在學(xué)術(shù)創(chuàng)新方面，論文產(chǎn)出規(guī)模連年增長，年度發(fā)文量逐年上升；在技術(shù)創(chuàng)新方面，專利申請量總體呈上升趨勢。

圖8 專利論文機構(gòu)對比圖

3.2 分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)涉及到各類領(lǐng)域分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在后期應(yīng)用過程中涉及面很廣，它不僅需要將各種技術(shù)工具與目前可用于培育優(yōu)良品種的相關(guān)材料有機結(jié)合起來，而且還是一個融合分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、作物育種學(xué)、計算機科學(xué)和生物信息學(xué)等多個學(xué)科的綜合工程[10]。其中分子標(biāo)記輔助育種論文涉及的領(lǐng)域主要以農(nóng)業(yè)、植物學(xué)、遺傳學(xué)和生物學(xué)為主；在專利上主要的研究對象有核酸片段、植物細(xì)胞、真菌和藻類。

3.3 分子標(biāo)記輔助育種越來越受到世界主要國家、國際農(nóng)業(yè)組織及各類機構(gòu)的重視分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域的相關(guān)論文發(fā)表量和專利申請量均呈增長態(tài)勢，雖然各類機構(gòu)和各個國家所注重的領(lǐng)域不同，但是分子標(biāo)記輔助育種的整體發(fā)展勢頭強勁。分子標(biāo)記輔助育種研發(fā)力量主要集中在中國、美國、加拿大、德國和印度等國家，其中中國論文發(fā)表量和專利申請量遙遙領(lǐng)先，體現(xiàn)了我國在分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究成果產(chǎn)出顯著，并有效驅(qū)動了技術(shù)創(chuàng)新，為分子育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。

3.4 高校和研究機構(gòu)在分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)用的側(cè)重點不同在論文發(fā)表方面，研究機構(gòu)和高校在論文發(fā)表數(shù)量上占有優(yōu)勢，其中美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國科學(xué)院占有重要地位。在專利申請方面，中國、美國、德國、瑞士和法國是專利申請總數(shù)最多的國家，其中企業(yè)在專利申請總量中占比最大。由此可見，文章發(fā)表和專利申請的情況在高校與企業(yè)中剛好呈現(xiàn)出相反態(tài)勢，這可能是因為高校更注重基礎(chǔ)研究，而企業(yè)更追求研究的產(chǎn)出效益。隨著世界各國技術(shù)壁壘的加劇，通過專利實現(xiàn)技術(shù)創(chuàng)新的保護越發(fā)重要，高校、科研院所在開展基礎(chǔ)研究的同時亦應(yīng)當(dāng)加強相關(guān)領(lǐng)域?qū)＠Ｗo力度。

4 展望

4.1 分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)將逐漸成熟科學(xué)研究的發(fā)展不僅反映在理論和技術(shù)方法的不斷發(fā)展完善方面，也反映在科技文獻以及專利數(shù)量的增長方面。隨著分子生物學(xué)研究的快速推進和不斷深化，原來的各種分子標(biāo)記已經(jīng)不能滿足育種的需要，新的分子標(biāo)記將向更大規(guī)模、更多位點的方向發(fā)展，并具有重復(fù)性好、密度高和操作簡單等優(yōu)點。同時，基因芯片、生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等新學(xué)科、新技術(shù)與分子標(biāo)記研究相結(jié)合，以及分子生物學(xué)與基因組學(xué)等學(xué)科的突破性進展均加速了分子標(biāo)記輔助育種的研究進程。近年來，低成本、高效率的測序技術(shù)使得全基因組大規(guī)模測序成為可能，從而形成了基于全基因組策略的分子選擇育種[11]。許多農(nóng)業(yè)科技發(fā)達國家或地區(qū)、國際農(nóng)業(yè)組織和國際大型農(nóng)業(yè)科技公司都特別重視作物分子標(biāo)記的開發(fā)、鑒定以及育種應(yīng)用，并在國家和地區(qū)層面的項目規(guī)劃中布局和資助了相關(guān)研究，如歐盟框架計劃[12]、美國國家植物基因組計劃（NPGI）[13]和英國生物技術(shù)與生物科學(xué)研究理事會（BBSRC）[14]等。隨著分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在育種產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用不斷推進，技術(shù)專利在美國、加拿大、澳大利亞、俄羅斯等農(nóng)業(yè)大國的國際化布局還將不斷拓展。

4.2 分子標(biāo)記輔助育種進行的研究和培育將越來越多樣化目前分子標(biāo)記輔助育種通常被用以提高作物的抗旱性和抗病性，在水稻、玉米和小麥等糧食作物中應(yīng)用最為廣泛。在抗旱性方面，可較好地應(yīng)用于作物抗旱基因的標(biāo)記輔助選擇；在抗病性方面，小麥赤霉病、水稻白葉枯病及白粉病等致病機理與綜合防治是研究的熱門領(lǐng)域。在進行作物育種時，利用基因聚合育種技術(shù)和基因混合育種技術(shù)分別與分子標(biāo)記輔助育種相結(jié)合，可將多個優(yōu)良基因?qū)胪荒繕?biāo)品種，提高育種效率。目前，分子標(biāo)記輔助育種主要用于連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀改良、目標(biāo)基因與分子標(biāo)記的連鎖定位及其對育種的影響分析[1]。采用的分子標(biāo)記技術(shù)也呈現(xiàn)多樣化，例如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD，Random amplified polymorphic DNA）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP，Amplified fragment length polymorphism）、簡單重復(fù)序列（SSR，Simple sequence repeats）、單核苷酸多態(tài)性（SNP，Single nucleotide polymorphism）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP，Restriction fragment length polymorphism）、序列標(biāo)簽位點（STS，Sequence tagged sites）和簡單重復(fù)序列間隔（ISSR，Inter-simple sequence repeats）等。分子標(biāo)記輔助育種作為一種高效的現(xiàn)代分子育種技術(shù)，其研發(fā)領(lǐng)域逐漸成為人們的關(guān)注熱點，相關(guān)論文發(fā)表和專利申請數(shù)量將持續(xù)增長。在今后，隨著這方面研究的不斷深入，分子標(biāo)記輔助育種亦將采用更加多樣化的標(biāo)記技術(shù)，為作物育種作出更大貢獻。