周忠會 周子琪 索朗歐珠

西藏職業(yè)技術學院農業(yè)科學技術學院，西藏 拉薩 850025

西藏貓乳(RhamnellagilgiticaMansf. et Melch.)為鼠李科貓乳屬植物，主要分布于我國西藏東南部、云南西北部、四川西南部，其莖的干燥木質部可入藥，具有燥濕、活血的作用，主治類風濕性關節(jié)炎、黃水病和高山多血病等癥[1]。研究表明，西藏貓乳中主要含有柚皮素、山萘酚、槲皮素、墨沙酮、花旗松素等黃酮類化合物[2-3]。這些黃酮類化合物多具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用，是西藏貓乳的主要活性成分[4]。

目前，西藏貓乳的提取主要采用水提法或醇提法[5]，所得產(chǎn)物雜質較多，純度較低，有必要尋找一種高效便捷的技術對總黃酮進行純化。大孔吸附樹脂因具有對有機組分的選擇性高、機械強度高、價格低廉、再生方便等特點,己廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[6-7]。但目前還未有大孔樹脂純化西藏貓乳總黃酮的報道。

本研究選用不同型號的大孔吸附樹脂分離純化西藏貓乳總黃酮，通過靜態(tài)吸附與解吸附及動態(tài)吸附與解吸附實驗考察其分離純化工藝[8]，并對抗氧化活性進行評價，旨在為西藏貓乳的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 西藏貓乳(西藏芒康地區(qū)，經(jīng)西藏職業(yè)技術學院任軍輝副教授鑒定，為鼠李科貓屬植物西藏貓乳RhamnellagilgiticaMansf.et Melch)；蘆丁標準品(中國生物制品檢定所，批號：100080-00707)；HPD-100、D101、AB-8、HPD-750、HPD-200L、HPD-600、ADS-F8、NKA-9型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；95%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180915)、亞硝酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180102)、硝酸鋁(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180208)、鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180316)、氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20110331)等試劑均為分析純。

1.2 儀器 HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司)；SHA-CA型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器(常州賽普實驗儀器廠)；101-B型數(shù)顯鼓風干燥箱(上海葉拓儀器儀表有限公司)；N-1110型旋轉蒸發(fā)儀(上海泉杰儀器有限公司)；SHD-(D)型循環(huán)水式多用真空泵(青島蘭特思科教儀器有限設備公司)；HPS-3C型PH測試儀(上海雷磁儀器有限公司)；YP202N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；L7雙光束紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 西藏貓乳總黃酮的提取 精密稱取西藏貓乳粗粉30.0 g于燒瓶中，加900 mL水加熱回流提取2次，每次提取1.5 h，合并提取液，置于旋轉蒸發(fā)儀濃縮至100 mL，置于燒杯中，得到西藏貓乳提取液,4 ℃儲藏備用。

2.2 西藏貓乳總黃酮的純度測定

2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品0.0320 g，用60%乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶,搖勻后得到蘆丁標準溶液。準確吸取標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL的量瓶中，分別加入60%乙醇使至5.0 mL,再分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻，靜置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入4% NaOH溶液10.0 mL，最后用體積分數(shù)為60%乙醇定容至25 mL，靜置15 min。以空白液為對照品，使用紫外分光光度計于510 nm波長處測量其吸光度。以蘆丁標準品溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線方程y=9.0811x+0.0701(R2= 0.9999)，線性范圍為0～0.1 mg/mL。

2.2.2 精密度 精密移取蘆丁對照品溶液2 mL，按2.2.1項下方法，同法測定吸光度，重復測定6次，記錄吸光度值。計算RSD值,結果顯示 RSD=0.78%，表明該方法、儀器的精密度較好。

表1 精密度實驗結果

2.2.3 穩(wěn)定性 取同一西藏貓乳提取液1 mL，按2.2.1項下方法，每隔10 min同法測定1次吸光度，記錄120 min內提取液的吸光度值。結果表明該供試品溶液在120 min內保持穩(wěn)定，RSD值為0.44%。

2.2.4 重復性 取同一批供試品西藏貓乳粗粉6份，每份約30 g，精密稱定，按2.1項下方法制備提取液，分別精密移取提取液1 mL，按2.2.1項下方法，同法測定，記錄吸光度值。結果顯示RSD=1.18%,表明該測定方法重復性較好。

表2 穩(wěn)定性實驗結果

表3 重復性實驗結果

2.2.5 加樣回收實驗 取已測總黃酮含量的西藏貓乳粗粉6份，每份約15 g，精密稱定，分別精密加入30.0 mg蘆丁標準品，按“2.1”項下方法處理，于510 nm處測定，計算回收率。得到平均回收率為99.78%,RSD值為0.40%,結果表明此法回收率良好。

表4 加樣回收實驗結果

2.2.2 西藏貓乳提取液中總黃酮濃度的測定 取適量西藏貓乳提取液按標準曲線測定方法操作，顯色后在510 nm波長處測定其吸光度，代入標準曲線方程計算樣液中黃酮的質量濃度,得到西藏貓乳提取液中總黃酮濃度為0.6 mg/mL。

2.3 大孔吸附樹脂純化西藏貓乳總黃酮

2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理 將8種樹脂(HPD-100、D101、AB-8、HPD-750、HPD-200L、HPD-600、ADS-F8、NKA-9)用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，傾倒上層懸浮顆粒和乙醇，再使用蒸餾水洗至樹脂無醇味，保存?zhèn)溆肹9]。

2.3.2 大孔吸附樹脂的選擇 準確稱取處理好的8種樹脂各2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入50 mL黃酮濃度為0.6 mg/mL的西藏貓乳提取液，恒溫恒速振蕩吸附24 h，取上清液，測定上清液總黃酮濃度，并按式①分別計算8種樹脂對黃酮的吸附率。將吸附飽和的樹脂過濾后，用去離子水洗至洗滌液無色，分別加入75%乙醇20 mL，恒溫恒速振蕩解吸附24 h，取上清液，測定上清液總黃酮濃度，并按式②分別計算8種樹脂的洗脫率[10]。

①

②

式中，C0為樣液黃酮初始質量濃度(mg/mL);C1為吸附飽和后樣液黃酮質量濃度(mg/mL);C2為解吸液黃酮質量濃度(mg/mL);V1為吸附液體積(mL);V2為解吸液體積(mL) 。

8種大孔樹脂對西藏貓乳總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸能力有所不同，這與大孔樹脂的極性、平均孔徑和比表面積有關[11]。結果如圖2所示，其中ADS-F8型樹脂對總黃酮的吸附率為94.56%、解吸附率為84.64%，吸附與解吸附效果優(yōu)于其他七種樹脂，這是由于ADS-F8型樹脂極性與西藏貓乳中黃酮類化合物極性較為接近，故選用ADS-F8型樹脂分離純化西藏貓乳。

2.3.3 大孔吸附樹脂純化西藏貓乳總黃酮工藝優(yōu)選

2.3.3.1 樣液pH對樹脂吸附率的影響 準確量取6份西藏貓乳提取液各50 mL置于燒杯中，用0.1 mol/mL鹽酸溶液調節(jié)至pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的樣液。稱取6份預處理后的ADS-F8樹脂置于具塞錐形瓶中，分別加入不同pH值樣液，于25 ℃、120 r/min振蕩吸附24 h，吸附飽和后，取上清液測定其總黃酮濃度，計算樹脂吸附率。

由圖3可知，在酸性條件下樹脂吸附率較高，當樣液pH為3.0時，吸附率最大，這可能是因為黃酮具有酚羥基結構，在酸性條件下以分子狀態(tài)存在，有利于大孔樹脂與黃酮之間進行物理吸附，但黃酮一般顯弱酸性，在樣液pH值太低的情況下，樣液中的部分黃酮會析出，導致樹脂的吸附率降低[12]，因此在樣液pH值為2時樹脂的吸附率低于pH值為3時，而隨著堿性增強，黃酮易解離成酸根離子，吸附作用降低[13]。因此，選擇樣液的最佳pH值為3.0。

2.3.3.2 樣液濃度對樹脂吸附率的影響 取等體積、總黃酮濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的西藏貓乳提取液，調節(jié)pH至2～3，準確稱取6份預處理后的ADS-F8樹脂各2.0 g置于具塞錐形瓶中，分別加入配置的不同濃度樣液，振蕩吸附24 h，吸附飽和后，取上清液測定其總黃酮濃度，計算樹脂吸附率。

由圖4可知，隨著上樣濃度的增大，吸附率先增大后減小，當濃度為0.6 mg/mL時，吸附率達到最大值，并隨著濃度的進一步增加而略有降低，這是因為隨著樣液濃度增加，與大孔樹脂單位表面積接觸的黃酮越多，吸附效果越好[14]；但樣液濃度過高，雜質含量也增加，樹脂容易堵塞[15]，考慮到實驗效率的問題，故選擇上樣濃度為0.6 mg/mL。

2.3.3.3 洗脫液濃度對解析率的影響 準確稱取預處理后的ADS-F8樹脂置錐形瓶中，分別加入總黃酮濃度為0.6 mg/mL、pH為2～3的西藏貓乳提取液50 mL,振蕩吸附24 h，吸附飽和后，取上清液測定其總黃酮濃度。將吸附飽和的樹脂過濾后，洗滌，分別加入50 mL濃度為50%～90%的乙醇，振蕩解吸附，測定洗脫液總黃酮濃度，計算樹脂解吸附率[16]。

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，解吸率升高，當濃度達到60%時，解吸率達到最大值，濃度繼續(xù)增加，解吸率反而降低。原因可能是西藏貓乳總黃酮在60%乙醇中溶解度達到最高，吸附在樹脂上的黃酮更容易解吸下來，但是乙醇體積分數(shù)過高，使大量醇溶性雜質也隨之洗脫下來，反而導致洗脫率降低。因此，選擇60%乙醇溶液作為最佳洗脫劑。

2.3.3.4 上樣液體積對樹脂吸附作用的影響 準確稱取ADS-F8樹脂各2.0 g，濕法裝柱(柱體積為50 mL)。取總黃酮濃度為0.6 mg/ mL、pH為3.0的西藏貓乳提取液以1 mL/min的流速上樣，收集流出液，每1 BV為一個收集段,共收集28 BV，測定每段收集液中黃酮的質量濃度，繪制動態(tài)泄露曲線[17]。

由圖6可知，當收集到第23份流出液時，流出液中總黃酮開始出現(xiàn)大量的泄漏，一般情況下，流出液的目標物質量濃度為上樣液目標物質量濃度1/10時，認為達到了目標物的泄漏點[18]，由圖可看出泄露點為23 BV左右，基于節(jié)約原料的原則，選擇上樣量為23 BV。

去年以來，西江廣東段沒有發(fā)生重特大水上交通安全事故，水上安全事故下降八成；成功救助遇險人員152人，搜救成功率99.25%，船舶違章行為明顯減少；西江岸線整治取得突破性進展，僅在肇慶段就清理取締非法碼頭、臨時裝卸點119個，打掉一大批非法采砂點；經(jīng)過沿線六市政府積極協(xié)作，西江沿岸投入建設了7個應急設備庫、13個溢油應急物資儲備點、4個防污應急服務點、3個拖輪值守點，水上應急能力和水污染防治能力進一步加強……

2.3.3.5 洗脫劑用量對解析率的影響 準確稱取預處理后的ADS-F8樹脂2.0 g，濕法裝柱，取總黃酮濃度為0.6 mg/mL、pH為3.0的西藏貓乳提取液上樣50 mL,吸附飽和后，用蒸餾水洗至洗脫液無色，將濃度為60%的乙醇分為50%、60%、70%、80%、90%的體積分數(shù)進行洗脫，每1 BV為1個收集段，共收集30 BV，測定每段洗脫液中總黃酮的質量濃度，繪制動態(tài)解吸曲線。

由圖7可知，在開始的2 BV，洗脫液中總黃酮質量濃度快速增加，在洗脫體積為2 BV時達到最大值，洗脫體積為2～8 BV時，總黃酮質量濃度逐漸減少，當洗脫體積為8 BV時，洗脫液中總黃酮濃度趨于0,說明洗脫已基本完全。因此，選擇8 BV作為最佳洗脫體積。

2.3.4 工藝驗證 取樹脂ADS-F8樹脂3份，采用確定的最佳工藝條件分離純化西藏貓乳總黃酮。對洗脫液進行干燥、稱重，驗證干燥物中總黃酮濃度。

選取ADS-F8型大孔吸附樹脂，取總黃酮濃度為0.6 mg/ mL、pH為3.0的西藏貓乳總黃酮提取液以適當流速上樣23 BV，用蒸餾水洗至洗脫液無色，60%乙醇以適當流速洗脫，洗脫體積為8 BV。結果表明，經(jīng)過純化后，樣品總黃酮濃度可由原來的17.13%上升至24.67%，精制倍數(shù)為1.44。表明此工藝條件適用于西藏貓乳總黃酮的分離純化，且穩(wěn)定可行。

表5 工藝驗證實驗結果

2.4 西藏貓乳總黃酮體外抗氧化研究

2.4.1 清除DPPH自由基能力 在96孔酶標板中，依次加入不同體積(30～100 μL)西藏貓乳生藥濃度為2 mg/mL的樣品溶液和200 μL濃度為1 mmoL/L的DPPH甲醇溶液，最后用甲醇補齊至總體積300 μL。室溫避光反應30 min，酶標儀測定其吸光度A1，以甲醇代替DPPH溶液測得吸光度A2，以甲醇代替樣品溶液測得空白吸光度A0。以維生素C作為陽性對照，每一濃度做3個平行樣品，取平均值[19]。清除DPPH自由基能力按下式計算：

由圖8可知，維生素C的抗氧化活性最強。西藏貓乳提取液在不同濃度下的自由基清除率均低于純化后西藏貓乳總黃酮，清除率穩(wěn)定后仍不足60%，IC50值為1.23 mg/mL。純化后西藏貓乳總黃酮的DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而逐漸上升，且在濃度達到1.6 mg/mL后趨于穩(wěn)定，此時清除率達到了65%以上，呈現(xiàn)出良好的清除效果。IC50值略低于純化前，為1.21 mg/mL。

由圖9可知，純化后的西藏貓乳總黃酮ABTS自由基抑制率在0.5～5 mg/mL濃度范圍內逐漸升高，在濃度為5 mg/mL時其清除率達到99.15 %，接近于維生素C水平，并高于西藏貓乳提取液，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。純化后的西藏貓乳總黃酮對ABTS自由基清除率的IC50值為1.13 mg/mL，低于純化前1.51 mg/mL,說明純化后西藏貓乳總黃酮抗氧化活性相比于純化前得到了提升。

2.4.3 FRAP法測定還原能力 將FeSO4溶液，與 TPTZ溶液和醋酸鹽緩沖液混合，吸取該混合液加入96孔板中，酶標儀于593 nm讀取吸光值。以FeSO4溶液的濃度為橫坐標，吸光值(A)為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線曲線方程為y=1.7963x+0.0209(R2=0.9996)[21]，線性范圍為0～0.16 mmoL/L。

純化后西藏貓乳總黃酮配置成系列濃度樣品，20 mmoL/L FeCl3·6H2O溶液、10 mmoL/L TPTZ溶液和醋酸鹽緩沖液按照1∶1∶10的比例混合后，酶標儀于593 nm處讀取吸光值A1，在孔中加入20 μL不同濃度的樣品，8 min后于593 nm處讀取吸光值A2，A2-A1的差值在標準曲線上獲得與樣品的還原力相當?shù)腇eSO4的濃度(μmoL/L)，定義為FRAP(Ferric Ion Reducing Antioxidant Power)值。按照上述實驗步驟，計算相同濃度維生素C的FRAP值，每一濃度做3個平行樣品，取平均值。

由圖10可知，純化后西藏貓乳總黃酮的Fe3+還原能力強于西藏貓乳提取液，當生藥濃度到達6 mg/mL時，還原能力趨于平穩(wěn)，濃度為10 mg/mL時，有最大還原能力，F(xiàn)RAP值為939.8 μmoL/L。

3 結論

大孔吸附樹脂分離純化技術具有操作方便、分離效果好、再生方便、經(jīng)濟成本較低一系列優(yōu)點，廣泛應用于皂苷、生物堿和黃酮成分的分離純化[22]。由于不同型號大孔吸附樹脂的極性、孔徑、比表面積等不同，其分離性質也會有較大差異[23]，故在本研究中，通過對所選8種樹脂進行靜態(tài)吸附與解吸附實驗，篩選出ADS-F8樹脂為分離純化西藏貓乳總黃酮的最佳樹脂，并通過單因素考察，最佳純化工藝條件為：樣液濃度0.6 mg/mL, pH值3.0，上樣體積23 BV，洗脫劑為60%的乙醇，洗脫體積8 BV。采用該純化工藝，所得總黃酮的濃度可提高至24.67%。

此次研究考察了純化后西藏貓乳總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，同時通過FRAP法測定其還原能力。在自由基清除實驗中，純化后總黃酮DPPH 自由基清除率大于65%，清除率相對于提取液有一定提升，純化后西藏貓乳總黃酮IC50值為1.21 mg/mL，比純化前有所降低，說明純化后總黃酮對DPPH自由基擁有更好的清除活性；在ABTS實驗中，純化后總黃酮IC50值為1.13 mg/ mL，低于西藏貓乳提取液，表明純化后總黃酮的自由基清除率高于西藏貓乳提取液。FRAP法即Fe3還原法，F(xiàn)e3+還原法是應用較廣泛的抗氧化能力評價方法，可間接評價樣品的抗氧化活性，此次研究中，純化后總黃酮的Fe3+還原能力高于西藏貓乳提取液，證明純化后總黃酮抗氧化能力更顯著。上述抗氧化實驗結果說明，純化后西藏貓乳總黃酮具有良好的抗氧化能力，且抗氧化能力優(yōu)于西藏貓乳提取液。

綜上，此次研究確定了西藏貓乳總黃酮分離純化相關工藝條件，并且發(fā)現(xiàn)純化后的西藏貓乳總黃酮具備良好的抗氧化活性，這為西藏貓乳進一步的研究與開發(fā)提供了實驗依據(jù)。