查 鑫 阮婧華 范東生 蘇松柏 夏 青 辛加敏 湯 謹(jǐn) 萬明香

貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

醫(yī)院制劑“柴葛暢原合劑”由陶氏柴葛解肌湯合藿香正氣散加減化裁而成[1],用于感冒風(fēng)寒、郁而化熱證。處方由葛根、柴胡、穿心蓮等十四味藥組成。葛根為君藥，解肌清熱、生津止渴[2]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明葛根主要藥效成分葛根素，具有抗炎、抗氧化等多種功能活性[3-5]，為葛根制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)[6-7]。目前醫(yī)院制劑柴葛暢原合劑相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚無含量檢測，難以保證該制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性。本試驗(yàn)采用HPLC法建立柴葛暢原合劑中葛根素的含量測定方法，以期完善柴葛暢原合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該操作簡單、專屬性高、靈敏高、重復(fù)程度強(qiáng)，能夠應(yīng)用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(waters E2695,美國waters公司)，二極管陣列紫外檢測器(Waters 2998，美國waters公司)；MS105DU天平(梅特勒-托和多儀器有限公司)。

1.2 試藥 柴葛暢原合劑(實(shí)驗(yàn)室自制，批號20200301、20200302和20200303)；葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-201615)；甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)；實(shí)驗(yàn)用水是實(shí)驗(yàn)室超濾設(shè)備MILLI-Q IQ 7000的過濾水；乙醇為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 um)，流動(dòng)相A為甲醇，B使用甲酸，其比例為30∶70，溫度控制在25 ℃，流速需達(dá)到1.0 mL/min，其波長250 nm，體積為10 uL。該物質(zhì)和其他色譜峰分離程度達(dá)到需要，時(shí)間共需要12 min，計(jì)算該物質(zhì)峰理論塔板數(shù)不低于4000。

2.2 溶液的制備 對照品溶液設(shè)置: 精準(zhǔn)稱量對照品5.4 mg，采用濃度為30%乙醇進(jìn)行稀釋定容至20 mL容量瓶中，最終濃度為0.27 mg/mL。從上述儲備液中取1 mL至10 mL的量瓶，30%乙醇定容，得濃度 0.027 mg/mL對照品溶液，4℃環(huán)境中儲存。

供試品溶液制作: 精準(zhǔn)吸取供試品1 mL至20 mL容量瓶中，30%乙醇定容，混勻，過0.22 μm濾膜，得供試品溶液。

陰性空白對照溶液: 按照相應(yīng)的比例以及相關(guān)的工藝制作陰性該物質(zhì)樣品，并依照相關(guān)的手段制作陰性空白對照。

2.3 專屬性試驗(yàn) 使用“2.2”中的對照品、供試品和陰性對照溶液，照“2. 1”項(xiàng)下檢測，對其結(jié)果進(jìn)行記錄。結(jié)果表明陰性對照不影響該物質(zhì)的測定。色譜圖如圖 1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對照品溶液 2.5 μL，5 μL，7.5 μL，10 μL，12.5 μL，15 μL，按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測。以檢測物質(zhì)的進(jìn)樣量(μg)作為橫軸(X)，峰面積為縱軸(Y)制作曲線，得到方程Y=4068.4X-84688(r2=0.9999)。其數(shù)據(jù)顯示，該物質(zhì)在0.0675 ～ 0.4050 μg和峰面積線性關(guān)系達(dá)到預(yù)期。

2.5 精密度試驗(yàn) 使用“2.4”項(xiàng)下的對照品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下，對其進(jìn)行分析并對其數(shù)據(jù)處理，重復(fù)6次操作，峰面積進(jìn)行詳細(xì)的記錄。結(jié)果該物質(zhì)的峰面積達(dá)到RSD為0.52%(n=6)，證明儀器的精密程度可以進(jìn)行試驗(yàn)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號202003 01)，在0、2、4、8、12、24 h，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下，對其進(jìn)行分析并對其數(shù)據(jù)處理，峰面積進(jìn)行詳細(xì)的記錄。結(jié)果表明，該物質(zhì)的峰面積達(dá)到RSD為1. 7% (n=6)，通過這一結(jié)果可以表明溶液在1日內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同的6份樣品( 批號20200301) ，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下進(jìn)行分析并對其數(shù)據(jù)處理，檢測其含量。結(jié)果表明該物質(zhì)的平均含量達(dá)到0.3217 mg/mL，RSD為1.9%(n=6)，證實(shí)該種方式能夠進(jìn)行重復(fù)測量。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已經(jīng)知道含量的同一批樣品(批號：20200301，樣品中葛根素含量為0.32 mg/mL)，精準(zhǔn)吸取規(guī)定體積樣品6份，精準(zhǔn)加入質(zhì)量為0.1601 mg葛根素對照品，按“2.2”項(xiàng)下制備相應(yīng)的供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下進(jìn)行分析并對其數(shù)據(jù)處理，算出回收率。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.9 樣品測定 取3批柴葛暢原合劑樣品，按“2.2”項(xiàng)下制作相應(yīng)的供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜環(huán)境下進(jìn)行分析并對其數(shù)據(jù)處理，分別進(jìn)樣檢測，計(jì)算該物質(zhì)的含量。見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 柴葛暢原合劑作為本院的院內(nèi)制劑之一，臨床療效良好、市場需求較大，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低，已不適應(yīng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化，因此本研究參照2015年版《中國藥典》第一部“葛根”項(xiàng)下含量測定方法，采用HPLC色譜法來測定柴葛暢原合劑中葛根素的含量。醫(yī)院制劑柴葛暢原合劑的君藥葛根中葛根素的含量測定進(jìn)行HPLC測定，選擇檢測波長為250 nm，嘗試流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)[8-9]、流速為1.0 mL/min等色譜條件，測定柴葛暢原合劑中葛根素的含量，其色譜峰保留時(shí)間較長，并沒有達(dá)到最佳分離效果。為達(dá)到最佳分離效果，相應(yīng)地調(diào)整了色譜條件，流動(dòng)相選用0.1%甲酸-甲醇(30∶70)，流速1.0 mL/min，葛根素峰保留時(shí)間為12 min左右,分離效果好，峰型理想。

3.2 樣品處理優(yōu)化 試驗(yàn)中曾用樣品揮干后加30%乙醇定容至20 mL加熱回流半小時(shí)，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，結(jié)果顯示，其峰面積和筆者所用的樣品處理方法峰面積相差不大，考慮到其簡單，好操作的特點(diǎn)，故筆者采取了“2.1”項(xiàng)下的樣品處理方法，此方法簡便，重復(fù)性，專屬性良好，特別適合醫(yī)院制劑室利用現(xiàn)有的設(shè)備條件進(jìn)行中藥制劑生產(chǎn)，控制質(zhì)量。

4 結(jié)論

醫(yī)院中藥制劑是指市場上不存在但臨床上必需且已獲準(zhǔn)生產(chǎn)的制劑類型。它們中的大多數(shù)是根據(jù)秘密秘方，處方或醫(yī)院處方開發(fā)的。常用的劑型有合劑，糖漿劑，顆粒劑和膠囊劑等，因?yàn)槠浏熜Э隙ㄇ沂芑颊呦矚g。近年來，很多新藥取締了院內(nèi)制劑，并投入了使用。除此之外，藥品監(jiān)督管理部門增加了監(jiān)督管理力度，醫(yī)院對中藥制劑的壓力也逐漸增加[10-12]。怎樣提高制劑品質(zhì)，開發(fā)可靠，放心，并且有治療效果的制劑，已成為中醫(yī)醫(yī)院發(fā)展過程中需考慮的關(guān)鍵，也是該領(lǐng)域相關(guān)人員需解決的任務(wù)[13-14]。筆者以醫(yī)院制劑柴葛暢原合劑為研究對象，以葛根素做為柴葛暢原合劑中含量測定的指標(biāo)，建立了高效液相測定其葛根素含量測定的方法。該方法操作簡單、專屬程度大、靈敏特異性高、重復(fù)性強(qiáng)，可以在該制劑的質(zhì)量控制階段使用。