檀龍顏 吳依琳 馬洪娜

貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

金蕎麥(Fagopyrumdibotry)為蓼科蕎麥屬(Fagopyrum)多年生草本植物，以干燥根莖入藥[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)[3]研究表明金蕎麥根據(jù)具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和增強(qiáng)免疫力的作用，在臨床上能夠治療呼吸系統(tǒng)疾病、腸道系統(tǒng)疾病和腫瘤等。同時(shí)，金蕎麥種子中富含蛋白質(zhì)、脂類和維生素等，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用[4]。此外，金蕎麥莖葉為牛羊等牲畜喜食，是一種優(yōu)良牧草[5]。因此，金蕎麥為一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的資源植物。種子是種子植物的繁殖體，也是植被恢復(fù)和重建的物質(zhì)基礎(chǔ)，而種子的生活力檢測是預(yù)判種子是否具有繁殖價(jià)值的重要手段[6]。本研究采用正交試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)和Central Composite Design 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì) TTC 法測定金蕎麥種子生活力的條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期種子為生物學(xué)研究和規(guī)?；a(chǎn)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料 金蕎麥種子采自貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院種植資源圃，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院檀龍顏副教授鑒定為金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)種子，采種后陰干，于4 ℃保存?zhèn)溆?。測定試劑為氯化三苯基四氮唑(TTC) 。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 種子浸泡：將去除雜質(zhì)，種皮無破損的金蕎麥種子置于燒杯中浸泡24 h后，從種子中間切斷，將胚切面較完整的每50個(gè)半粒種子置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。種子染色：方法同馬洪娜等[6]。

1.2.2 正交試驗(yàn) 選取TTC濃度(A) (0.3%、0.5%、0.7%)、染色溫度(B)(35 ℃、40 ℃、45 ℃)、染色時(shí)間(C)(2 h、3 h、4 h)3個(gè)因素的不同水平，每組50個(gè)半粒種子，通過正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.2.3 單因素試驗(yàn) ①染色時(shí)間試驗(yàn)：取50個(gè)金蕎麥半粒種子，TTC濃度設(shè)置為0.5%，溫度設(shè)置為40℃，時(shí)間設(shè)置1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和5個(gè)水平;②染色溫度試驗(yàn)：取50個(gè)金蕎麥半粒種子，TTC濃度設(shè)置為0.5%，時(shí)間設(shè)置為4 h，溫度設(shè)置30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃等5個(gè)水平;③染色TTC濃度試驗(yàn)：取50個(gè)金蕎麥半粒種子，溫度設(shè)置為40 ℃，時(shí)間設(shè)置為4 h，TTC濃度設(shè)置為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%等5個(gè)水平。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 以TTC濃度(A)、染色溫度(B)、染色時(shí)間(C)為變量，依據(jù)Central Composite Design設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素5水平試驗(yàn)。每個(gè)處理50個(gè)金蕎麥半粒種子。以種子生活力為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 種子生活力根據(jù)染色顏色的深淺和比率計(jì)算，利用SPSS17.0軟件和Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，組合為TTC濃度0.3%，染色溫度35℃，染色時(shí)間2 h的金蕎麥種子生活力最低(59.3%), 組合染色溫度40 ℃，TTC濃度0.5%，染色時(shí)間3 h種子生活力最高(85.2%)。方差分析結(jié)果顯示，因素TTC染色濃度差異顯著，染色溫度和染色時(shí)間均差異不顯著(表2)。

表1 金蕎麥種子生活力測定正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 種子生活力測定正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果 從表3可以看出，隨著染色時(shí)間增加，顏色由黃色到粉色再到深紅色，1～ 4 h種子生活力逐漸增加，5 h時(shí)種子生活力顯著降低，種子活力最高為染色4 h。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗(yàn)法的最佳染色時(shí)間選擇為4 h。

表3 金蕎麥種子生活力與染色時(shí)間的關(guān)系

當(dāng)TTC濃度從0.1 % ～ 0.5 %時(shí)，金蕎麥種子的生活力逐漸增大，染色顏色由淺粉色到粉色、紅色，其中TTC濃度為0.5%時(shí)最大。當(dāng)TTC濃度為0.7%時(shí)和0.9%時(shí)，染色顏色為深紅色，但種子的活力下降下降。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗(yàn)法的最佳TTC濃度為0.5%(表 4)。

表4 金蕎麥種子生活力與TTC濃度的關(guān)系

染色溫度為30 ℃ ～ 40 ℃之間的金蕎麥種子，種子生活力逐漸增大，胚顏色由淺粉色到淺紅色和紅色。當(dāng)溫度超過40℃時(shí)，種子生活力反而隨著溫度的升高而降低，胚顏色也從黃白色至白色，說明種子并沒有被TTC染色。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗(yàn)法最佳溫度為40 ℃(表 5)。

表5 金蕎麥種子活力與染色溫度的關(guān)系

基于以上的3個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，金蕎麥種子生活力TTC測定法的單因素試驗(yàn)中，TTC濃度(0.5%)×染色溫度(40 ℃)×染色時(shí)間(4 h)為最佳條件，該結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相近。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，3個(gè)因素對(duì)金蕎麥種子生活力測定影響差異極顯著，且各因素的影響順序?yàn)槿旧珳囟?染色時(shí)間>TTC濃度。

表6 金蕎麥種子生活力測定響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表7 金蕎麥種子生活力測定響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

2.3.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面試驗(yàn)法中，響應(yīng)面圖曲面坡度的陡峭程度，能直觀體現(xiàn)各兩個(gè)因素的交互作用對(duì)種子生活力響應(yīng)值的影響。其中，染色溫度與TTC濃度的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響最大(圖1)，響應(yīng)面的傾斜度最高，其次是TTC濃度與染色時(shí)間(圖2)，最后是染色溫度與染色時(shí)間(圖3)。通過響應(yīng)面法優(yōu)化，試驗(yàn)組TTC濃度(0.5%)×染色溫度(40 ℃)×染色時(shí)間(4 h)是金蕎麥種子生活力TTC法測定的最佳條件，此組合下，理論種子生活力為87.8%。在此條件下，進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)測生活力為86.72%、86.93%、86.7%，平均生活力為86.78%。試驗(yàn)生活力測定值與理論預(yù)測值的誤差為1.02%(<5%)，因此，應(yīng)用Design-Expert中的Central Composite Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化金蕎麥種子TTC法測定條件是可行的。

3 討論

3.1 利用響應(yīng)面優(yōu)化能得到較為精確的試驗(yàn)參數(shù) 盡管正交試驗(yàn)?zāi)軌驕p少工作量，且具有高效、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，但是正交試驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果不會(huì)超越所取水平的范圍，不是很精確。單因素講究效率，但是篩選的參數(shù)范圍不是很精確。因此，無論是單因素試驗(yàn)還是正交試驗(yàn)都有一定的缺限。而本試驗(yàn)種響應(yīng)面分析優(yōu)化金蕎麥種子生活力測定的最佳條件為TTC濃度(0.5 %)×染色溫度(40℃)× 染色時(shí)間(4 h)，與正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的結(jié)果相近或一致。表明單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)合，同時(shí)利用響應(yīng)面法優(yōu)化，則能得到較為可靠的試驗(yàn)參數(shù)。

3.2 響應(yīng)面分析法能在更廣闊的領(lǐng)域應(yīng)用 響應(yīng)面分析法利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題，一般在工程類工藝設(shè)計(jì)中應(yīng)用較為廣泛。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，頭花蓼種子[7]和羊耳菊種子[8]，以及山豆根種子[6, 9]生活力測定中，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化相應(yīng)測定條件已獲得了較好的結(jié)論，且本文結(jié)果也表明利用響應(yīng)面分析優(yōu)化金蕎麥種子生活力測定條件是可行的。因此，響應(yīng)面分析法的應(yīng)用面較廣，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用。