覃文玉 楊丹淇 張源文 王映雪 劉 楊，2 劉 明，2*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥、民族藥藥理作用及作用機(jī)制研究中心，貴州 貴陽 550025

2015年版《藥典》收載的“都梁丸”由白芷、川芎(白芷：川芎=4:1)組成，具有祛風(fēng)散寒、活血通絡(luò)的功效，用于風(fēng)寒瘀血阻滯脈絡(luò)所致的頭痛，癥見頭脹痛或刺痛、痛有定處、反復(fù)發(fā)作、遇風(fēng)寒誘發(fā)或加重[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白芷-川芎藥對的鎮(zhèn)痛作用顯著[2-3]，但其鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制不明。筆者采用醋酸致小鼠扭體實驗，觀察白芷-川芎藥對的鎮(zhèn)痛及其調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級KM小鼠42只，雌雄各半，體重18～22 g，購于湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物與試劑 白芷，購買于貴州藥材市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室吳之坤副教授鑒定為川白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的根；川芎，購買于貴州藥材市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室吳之坤副教授鑒定為川芎LigusticumchuanxiongHort.的根莖；阿司匹林腸溶片(批號：201904178，辰欣藥業(yè)股份有限公司)；醋酸(批號：20181217，湖南爾康制藥股份有限公司)；5-HT、PGE2試劑盒(批號分別為：NO.20190725B、NO.20190723A，武漢博士德公司)；DA抗體(批號：NO.ab19316，Abcam公司)。

1.3 儀器 680型全自動酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)，電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥物制備 取白芷10 g，川芎2.5 g(2015年版《藥典》收載的白芷、川芎單用量均為3～10 g，本研究選擇白芷10 g∶川芎2.5 g=4∶1作為都梁丸的處方，人的體重按照60 kg計算，則人日用都梁丸為生藥量12.5 g/60 kg，小鼠劑量設(shè)為 2.08 g/kg，相當(dāng)于人用量的10倍。)，參照文獻(xiàn)方法[4]，經(jīng)70%乙醇滲漏提取，回收乙醇，濃縮，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 醋酸致小鼠扭體實驗 取KM小鼠42只，隨機(jī)分為3組，即正常對照組、白芷-川芎藥對組、阿司匹林組，雌雄各半，每組14只。灌胃給予相應(yīng)的藥物，20 mL/kg，每日1次，連續(xù)7次，正常對照組給予等容量的生理鹽水灌胃。末次給藥0.5 h，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液 0.2 mL，立即計時，觀察記錄注射醋酸后15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體次數(shù)，并計算鎮(zhèn)痛百分率。

鎮(zhèn)痛百分率(%)=(正常對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/正常對照組平均扭體次數(shù)×100%

1.4.3 ELISA檢測腦組織5-HT、PGE2含量 注射醋酸后30 min，處死小鼠，分離大腦，隨機(jī)取7只小鼠的大腦加9倍的預(yù)冷生理鹽水勻漿，3500 r/min離心20 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測5-HT、PGE2含量。

1.4.4 Western blot檢測腦組織DA蛋白表達(dá) 另取7只小鼠大腦，液氮凍存，根據(jù)試劑盒說明，做大腦總蛋白提取后，BCA法蛋白定量。按試劑盒操作步驟制備濃度12%分離膠和濃度5%濃縮膠，80 V電壓電泳2 h后60 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗，β-actinⅠ抗?jié)舛?∶6000、DAⅠ抗1∶500，Ⅰ抗4℃孵育過夜后加入Ⅱ抗1∶10000，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL顯影，上機(jī)檢測，以β-actin作為內(nèi)參，灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 白芷-川芎藥對對小鼠扭體反應(yīng)的影響 白芷-川芎藥對組能明顯減少扭體次數(shù)，其鎮(zhèn)痛百分率達(dá)到60.9%，高于阿司匹林組的51.3%，表明白芷-川芎藥對具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。見表1。

表1 白芷-川芎藥對對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

2.2 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織5-HT、PGE2含量的影響 白芷-川芎藥對組能明顯增加小鼠時腦組織中5-HT的水平，減少PGE2的含量。見表2。

表2 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織5-HT、PGE2含量的影響

2.3 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織DA表達(dá)的影響 白芷-川芎藥對組能明顯增加小鼠腦組織中DA的表達(dá)。見表1、如圖1所示。

表3 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織DA表達(dá)的影響

3 討論

白芷是一味歷史悠久且應(yīng)用十分廣泛的中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，味辛、苦、溫，歸肝、腎、膀胱經(jīng)，有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效，同時有消瘀、止血、通便等作用，可用于治療風(fēng)寒感冒、陽明頭痛、眉棱骨痛、風(fēng)濕痹痛等癥，是治療陽明經(jīng)頭痛的要藥[5]。川芎，別名芎藭、生川軍、香果，辛溫香燥，走而不守，既能行散，上行可達(dá)巔頂；又入血分，下行可達(dá)血海，常用于活血行氣，祛風(fēng)止痛之證[6]。白芷、川芎均為祛風(fēng)止痛之藥，均可上行頭目并分別入太陽經(jīng)和陽明經(jīng)。古方以白芷一味為都梁丸洽諸風(fēng)眩暈，偏正頭痛甚佳。近代都梁丸則含白芷、川芎兩味，用于頭痛眩暈，眉棱骨痛，僧寒發(fā)熱。諸多止頭痛方中含白芷、川芎藥對[7]。

身體的疼痛通常是指由身體損傷、病患或不良的外部刺激所引起的不舒服感覺[8]。出于臨床的需要，國際疼痛研究協(xié)會將疼痛定義為“由真正存在或潛在的身體組織損傷所引起的不舒服知覺和心理感覺”。盡管疼痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但已有的研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛的發(fā)生、發(fā)展過程中占據(jù)重要的地位。PGE2是一種重要的細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)因子，是前列腺素的一種，也是一種重要的疼痛遞質(zhì)之一，存在于動物和人體中，其過量增加會引起疼痛產(chǎn)生。5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其含量增加也能減少疼痛。DA是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，是內(nèi)源性含氮有機(jī)化合物，其蛋白含量表達(dá)增加能夠興奮大腦，起到減輕疼痛的作用[9]。盡管一般認(rèn)為，扭體法適合評價外周鎮(zhèn)痛，熱板法適合評價中樞鎮(zhèn)痛，但也有研究表明[10]在醋酸致小鼠扭體實驗中，小鼠大腦組織中PGE2含量顯著下降，故本研究選擇小鼠扭體實驗觀察白芷-川芎藥對對腦神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。

本研究結(jié)果顯示，白芷-川芎藥對具有明顯的減少醋酸致小鼠扭體反應(yīng)數(shù)，降低腦組織中PGE2的含量，增加腦組組中5-HT含量及DA蛋白表達(dá)水平，這與相關(guān)的報道一致，提示白芷-川芎藥對發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用可能是通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，從而影響疼痛遞質(zhì)的水平而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。課題組后續(xù)將繼續(xù)深入研究白芷-川芎藥對鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。課題組后續(xù)將繼續(xù)深入研究白芷-川芎藥對鎮(zhèn)痛的部位、物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。