何 燕，陳 鵬(.成都市第六人民醫(yī)院內(nèi)科，成都 6005；2.成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 6003)

阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAS)是一種臨床常見的睡眠期疾病，在成年男性中多發(fā)，且患病率隨年齡遞增[1]。OSAS是由于睡眠狀態(tài)下，上呼吸道塌陷使氣道狹窄或者阻塞，導(dǎo)致慢性間接性缺氧，患者突出的臨床表現(xiàn)為睡眠伴打鼾、憋醒、白天嗜睡等。此外，OSAS可導(dǎo)致腦供氧量降低，腦細(xì)胞神經(jīng)功能異常，并增加心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。OSAS患者普遍存在認(rèn)知障礙，主要表現(xiàn)為短期記憶力、注意力、執(zhí)行能力、警覺性差等[3]。金釵石斛生物堿是從傳統(tǒng)中藥金釵石斛中提取而來，具有抗腫瘤、降血脂、保護(hù)神經(jīng)等藥理作用。有研究表明，金釵石斛生物堿可減輕大鼠海馬神經(jīng)元損傷，改善大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能[4]。本研究基于凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1)/天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9)通路研究金釵石斛生物堿對OSAS大鼠認(rèn)知功能和記憶力的改善作用，為金釵石斛堿在OSAS臨床治療中的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 5417R高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Icycler實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀(美國Bio-Rad公司)；多導(dǎo)睡眠監(jiān)護(hù)儀(美國Neurotronick公司)，配套使用Polysmith分析軟件；BMJ-3包埋機(jī)(常州中威電子儀器廠)；BX-70光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；iWorx多通道生理信號記錄儀(海玉妍科學(xué)儀器有限公司)，配套使用LabScribe數(shù)據(jù)采集軟件；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2試藥 質(zhì)量濃度0.1 g·mL-1水合氯醛(上海羽朵生物科技有限公司)；透明質(zhì)酸鈉凝膠(常州藥物研究所有限公司)；金釵石斛生物堿(成都普斯生物科技股份有限公司)；丁苯酞注射液(石家莊石藥集團(tuán)有限公司)；細(xì)胞裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Sigma公司；蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白免疫印跡試劑盒(德國PerkinElmer公司)；原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick and labeling，TUNEL)試劑盒(美國羅氏公司)；引物設(shè)計(jì)委托生工生物工程(上海)股份有限公司；兔Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗和山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司。

1.3動物 3月齡SPF級SD雄性大鼠60只(體質(zhì)量320～340 g，北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1建模及給藥方法 自60只大鼠中隨機(jī)挑選50只建立OSAS模型，余下10只列入對照組。建模組大鼠使用質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1的水合氯醛腹腔注射麻醉，模擬大鼠睡眠時(shí)的狀態(tài)：受較弱刺激時(shí)無反應(yīng)，受較強(qiáng)刺激時(shí)有反應(yīng)，此時(shí)大鼠腦電出現(xiàn)睡眠期特征(低頻率、高幅度)。使用開口器，暴露大鼠口咽腔。將透明質(zhì)酸鈉凝膠注入大鼠舌腭弓、咽腭弓和舌根處，直到大鼠出現(xiàn)呼吸暫停。對照組在相同位置注射等量生理鹽水。使用多導(dǎo)睡眠儀觀察大鼠呼吸、腦電和血氧飽和度直到大鼠完全清醒。OSAS建模成功的標(biāo)準(zhǔn)如下。呼吸暫停：口鼻氣流停止時(shí)間長于10 s；低通氣：氣流強(qiáng)度降低超過50%正常氣流強(qiáng)度，并且血氧飽和度降低超過3%，或者伴隨輕微覺醒。當(dāng)呼吸暫停次數(shù)和低通氣指數(shù)(apnea-hypopnea index，AHI)≥5次·h-1，記作大鼠OSAS模型建模成功[5]。將成功建模的大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，金釵石斛生物堿高、中、低劑量組和丁苯酞組。金釵石斛生物堿高、中、低劑量組分別用0.36、0.18和0.09 g·kg-1金釵石斛生物堿灌胃，丁苯酞組用40 mg·kg-1的丁苯酞灌胃，模型組和對照組分別用等體積的生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)處理12周。

2.2大鼠認(rèn)知能力檢測 處理后，應(yīng)用曠場實(shí)驗(yàn)分析大鼠的認(rèn)知能力。使用長、寬、高均為60 cm的正方體敞箱，底部有5 cm正方形方格，將大鼠放置在中央格，令其自由活動，使用圖像監(jiān)視系統(tǒng)觀測大鼠探索總里程、中央方格停滯時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束均使用質(zhì)量濃度為0.85 g·mL-1的乙醇去除大鼠殘留的氣味。

2.3大鼠記憶力檢測 處理后，通過新位置識別實(shí)驗(yàn)研究大鼠的記憶力。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 d后，將大鼠放置于玻璃箱內(nèi)，將2個(gè)相同物體平行置于同一角落，任大鼠自由探索10 min，記錄大鼠對該2個(gè)物體的探索時(shí)間。探索結(jié)束后，將大鼠放回飼養(yǎng)籠中。1 h后，將其中的一個(gè)物體改變位置，置于箱子中央。再次將大鼠放置在玻璃箱內(nèi)觀察大鼠對2個(gè)物體的探索時(shí)間。將識別記憶指數(shù)作為評價(jià)大鼠記憶能力的指標(biāo)。識別記憶指數(shù)=[新位置探索時(shí)間/(新位置探索時(shí)間+舊位置探索時(shí)間)]×100%。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束均使用質(zhì)量濃度為0.85 g·mL-1的乙醇去除大鼠殘留氣味。

2.4大鼠海馬角1區(qū)組織病變觀察 通過HE染色對大鼠海馬角1(cornus ammonis 1，CA1)區(qū)組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。取大鼠CA1區(qū)組織，使用質(zhì)量濃度為0.04 g·mL-1的多聚甲醛固定24 h后，使用石蠟包埋，將組織石蠟塊切成厚度為4 μm的切片，經(jīng)過脫蠟復(fù)水后，對切片進(jìn)行HE染色。使用中性樹脂封片，在光鏡下觀察。

2.5大鼠海馬角1區(qū)神經(jīng)元凋亡檢測 通過TUNEL檢測大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況。海馬CA1區(qū)組織切片制備方法同上，脫蠟復(fù)水后，滴加100 μL蛋白酶K工作液，37 ℃孵育15 min，按照TUNEL試劑盒說明書依次加入封閉液、TdT酶反應(yīng)液、HRP工作液和DAB顯色液后，置于光鏡下觀察，每組選擇5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和視野中的細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.6大鼠海馬組織中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量檢測 應(yīng)用RT-qPCR檢測大鼠海馬組織中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量。取大鼠大腦海馬區(qū)組織研磨成勻漿，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照自NCBI基因庫中查找到的Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA序列，設(shè)計(jì)上、下游引物，見表1。設(shè)置退火溫度為56 ℃，40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，依據(jù)2-△△CT計(jì)算出Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequence and amplification product length

2.7大鼠海馬組織中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)水平檢測 應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blot,WB)檢測大鼠海馬組織中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax 蛋白的相對表達(dá)量。取大鼠大腦海馬區(qū)組織研磨成勻漿，加入細(xì)胞裂解液提取腦組織總蛋白，并上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用脫脂牛奶室溫孵育封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，使用磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline twen，PBST)洗膜3次后更換二抗，室溫孵育2 h后，顯色。根據(jù)條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，分析Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白的相對表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1大鼠認(rèn)知能力檢測 48只大鼠建模成功，2只大鼠在建模過程中窒息死亡被剔除。各組大鼠分組情況：對照組10只，模型組和丁苯酞組各9只，金釵石斛生物堿高、中、低劑量組各10只。模型組大鼠探索總里程長于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均短于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組相比，金釵石斛生物堿高劑量組減小(P<0.05)，低劑量組增加(P<0.05)；模型組中央方格停滯時(shí)間短于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均長于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組延長(P<0.05)，低劑量組縮短(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of open field experiment of rats

3.2大鼠記憶力檢測 大鼠記憶識別指數(shù)模型組低于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組升高(P<0.05)，低劑量組降低(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠新位置識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Experimental results of new position recognition in rats

3.3大鼠組織病理學(xué)觀察 對照組海馬CA1結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，核仁清晰。模型組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，排列紊亂，神經(jīng)元出現(xiàn)明顯腫脹，核仁消失并出現(xiàn)壞死細(xì)胞。丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，其中金釵石斛生物堿高劑量組與對照組較為相似。見圖1。

圖1 HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)病理變化(×400)Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of hippocampal CA1 area (×400)

3.4海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 細(xì)胞凋亡指數(shù)模型組高于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組降低(P<0.05)，低劑量組升高(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 TUNEL檢測大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡(×400)Fig.2 TUNEL to detect the apoptosis of hippocampal CA1 neurons (×400)

表4 細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測結(jié)果Tab.4 Results of apoptosis indexes

3.5大鼠海馬組織中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量檢測 Apaf-1、Caspase-9和Bax mRNA的相對表達(dá)量模型組均高于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組均降低(P<0.05)，低劑量組均升高(P<0.05)；Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量模型組低于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組升高(P<0.05)，低劑量組降低(P<0.05)，見表5。

表5 RT-qPCR檢測大鼠海馬組織中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量 Tab.5 Relative mRNA expressions of Apaf-1，caspase-9，Bcl-2 and Bax in rat hippocampus detected by RT-qPCR

3.6大鼠海馬組織中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平檢測 Apaf-1、Cleaved Caspase-9和Bax蛋白表達(dá)水平模型組高于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組降低(P<0.05)，低劑量組升高(P<0.05)；pro-Caspase-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平模型組低于對照組(P<0.05)，丁苯酞組及金釵石斛生物堿高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05)，與丁苯酞組比較，金釵石斛生物堿高劑量組升高(P<0.05)，低劑量組降低(P<0.05)，見圖3、表6。

圖3 WB檢測大鼠海馬組織中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平Fig.3 Protein expression levels of Apaf-1，pro-caspase-9，cleaved caspase-9，Bcl-2 and Bax in rat hippocampus detected by WB

表6 WB檢測大鼠海馬組織中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平Tab.6 Protein expression levels of Apaf-1，pro-caspase-9，cleaved caspase-9，Bcl-2 and Bax in rat hippocampus detected by WB

4 討論

OSAS的發(fā)病機(jī)制與眾多因素有關(guān)，如吸煙、肥胖、基因遺傳、年齡和性別等[6]。OSAS可導(dǎo)致包括認(rèn)知、記憶功能障礙在內(nèi)的全身多臟器漸進(jìn)性疾病[7]。有研究表明，OSAS可引起海馬和額葉皮層區(qū)損傷，導(dǎo)致認(rèn)知障礙[8]。持續(xù)氣道正壓通氣法可有效治療OSAS，但患者常出現(xiàn)依從性差，導(dǎo)致該方法使用受限[9]。因此，尋找改善由OSAS導(dǎo)致的認(rèn)知、記憶功能障礙的新療法具有重要臨床價(jià)值。金釵石斛是我國傳統(tǒng)中藥，具有清虛清熱、滋陰養(yǎng)津的功效。生物堿是金叉石斛藥效的主要成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)神經(jīng)等作用[10]。有研究表明，金叉石斛生物堿可改善大鼠神經(jīng)元損傷[11]。因此，本研究使用金叉石斛生物堿治療OSAS大鼠認(rèn)知、記憶力減退具有可行性。丁苯酞是臨床常見的神經(jīng)保護(hù)類藥物，可抑制神經(jīng)元凋亡，提高急性腦卒中、血管性癡呆等患者的認(rèn)知和記憶能力[12]。因此，本研究使用丁苯酞作為陽性對照藥物具有可比性。

曠場實(shí)驗(yàn)常被用于檢測實(shí)驗(yàn)動物的認(rèn)知能力，新位置識別實(shí)驗(yàn)則用于檢測實(shí)驗(yàn)動物的記憶能力[13-14]。本研究曠場實(shí)驗(yàn)和新位置識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OSAS模型大鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知、記憶障礙。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OSAS大鼠自主活動能力、認(rèn)知能力受限。新位置識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OSAS大鼠短期識別記憶能力降低。經(jīng)過金釵石斛生物堿處理后，OSAS大鼠認(rèn)知、記憶能力均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。海馬是大腦神經(jīng)元較豐富的區(qū)域，是大腦學(xué)習(xí)和記憶儲存的解剖基礎(chǔ)，同時(shí)也是對缺氧最敏感的區(qū)域之一，易出現(xiàn)神經(jīng)元病變。本研究通過HE染色觀察大腦海馬CA1區(qū)病變，結(jié)果顯示，OSAS大鼠神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元形態(tài)出現(xiàn)明顯腫脹，核仁消失，細(xì)胞壞死。而經(jīng)過金釵石斛生物堿處理后，海馬CA1區(qū)組織病變明顯好轉(zhuǎn)，由此表明，金釵石斛生物堿可減輕大鼠海馬CA1區(qū)組織病變。此外，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)金釵石斛生物堿處理后，海馬CA1區(qū)細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著低于OSAS模型大鼠，由此可知，金釵石斛生物堿可抑制大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。

Apaf-1是神經(jīng)元凋亡過程中重要的分子之一，Apaf-1可釋放細(xì)胞色素C，與Caspase-9形成復(fù)合物，誘導(dǎo)pro-Caspase-9裂解，形成Cleaved Caspase-9，從而啟動細(xì)胞凋亡程序[15]。Caspase-9是Caspase凋亡級聯(lián)瀑布反應(yīng)的啟動蛋白酶，是凋亡程序啟動的開關(guān)[16]。有研究表明，在由腦缺血引起的神經(jīng)功能缺失大鼠腦組織中可檢測出Apaf-1/Caspase-9通路異常激活，引起下游Bax的表達(dá)升高、Bcl-2表達(dá)降低[17]。Bax是廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮促凋亡作用的分子，與Bcl-2發(fā)揮拮抗作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[18]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡與大鼠認(rèn)知、記憶能力障礙的發(fā)生有關(guān)。有研究表明，大鼠海馬CA1區(qū)Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低，可造成腦神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而引起大鼠認(rèn)知功能障礙[19]。本研究結(jié)果顯示，OSAS大鼠海馬組織中Apaf-1、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白均呈高表達(dá)而Bcl-2呈低表達(dá)，經(jīng)金釵石斛生物堿處理后，Apaf-1、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低，而Bcl-2的表達(dá)水平升高，由此可推測，金釵石斛生物堿可改善OSAS大鼠認(rèn)知、記憶能力障礙，可能與抑制Apaf-1/Caspase-9通路、下調(diào)Bax表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，金釵石斛生物堿可改善OSAS大鼠認(rèn)知、記憶力障礙，減輕其腦組織病理損傷，抑制細(xì)胞凋亡，推測其機(jī)制可能與抑制Apaf-1/Caspase-9通路、下調(diào)Bax表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。影響OSAS大鼠認(rèn)知、記憶力的因素較為復(fù)雜，金釵石斛生物堿是否通過影響其他因素發(fā)揮功效，尚有待進(jìn)一步研究。