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        基于UPLC/Q-TOF/MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究甘草渣活性部位治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機制

        2021-02-28 04:02:14徐曉琴王鈞篪斯建勇卿德剛中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所北京0093新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所烏魯木齊83000
        西北藥學(xué)雜志 2021年6期
        關(guān)鍵詞:靶點細胞因子調(diào)控

        張 娟,徐曉琴,王鈞篪,孫 宇,斯建勇*,卿德剛*(.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所,北京 0093;.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所,烏魯木齊 83000)

        潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種以潰瘍形成和慢性炎癥為主要病理特點的消化道疾病,病變多累及直腸和乙狀結(jié)腸,也可遍及整個結(jié)腸。UC的發(fā)作期與緩解期反復(fù)交替,病程冗長,難治愈,復(fù)發(fā)率高,并且超過20%的患者會在30年內(nèi)發(fā)展為致死率高達50%的炎癥性結(jié)腸癌(colitis-associated cancer,CAC)[1]。目前,尚無有效治療UC的手段,更無有效預(yù)防UC炎-癌轉(zhuǎn)化的手段,開發(fā)高效、低毒的治療UC和預(yù)防UC向癌癥發(fā)展的活性成分仍然是十分必要的。

        前期的研究證實,來源于甘草渣的活性部位(GC)可以通過干預(yù)在UC發(fā)生、發(fā)展中起中心調(diào)控作用的NF-кB通路發(fā)揮抗炎作用,通過干預(yù)Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用,從而對UC起到治療作用[2-3],并且其對CAC也有緩解作用[4],具有較大開發(fā)價值。GC雖然是經(jīng)過富集的活性部位,但是其化學(xué)成分仍然復(fù)雜,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制都不清楚。因此,本研究在應(yīng)用UPLC/Q-TOF/MS系統(tǒng)分析GC化學(xué)成分的基礎(chǔ)上,進一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對GC治療UC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機制進行了分析,建立潛在活性成分-靶點-通路的關(guān)系,探究GC治療UC的多成分、多靶點和多途徑作用機制,為后續(xù)研究提供思路。

        1 儀器與試藥

        1.1儀器 Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色譜儀(日本SHIMAZU公司);Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);Heraeus Fresco 17離心機(美國Thermo Fisher公司);BSA124S-CW電子天平(德國Sartorius公司);YM-080S超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司);ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱。

        1.2試藥 GC樣品為自制;甲醇、乙腈、甲酸均為LC-MS級,均購自德國CNW公司。

        2 方法

        2.1數(shù)據(jù)來源

        2.1.1GC化學(xué)成分鑒定 精密稱定0.1 g GC樣品,以體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇3 mL超聲溶解。色譜柱為UPLC BEH C18,流動相為1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫,進樣量5 μL,洗脫條件見表1。質(zhì)譜儀:轟擊能量40 eV,碰撞能差20 V。ESI離子源:霧化氣壓55 psi,輔助氣壓55 psi,氣簾氣壓35 psi,550 ℃,噴霧電壓5 500 V(正離子模式)或-4 000 V(負離子模式)。

        表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

        2.1.2GC潛在靶點的收集與預(yù)測 通過DrugBank、CTD、STITCH和SwissTarget數(shù)據(jù)庫收集并預(yù)測GC各化學(xué)成分的靶點,進而依據(jù)靶點得分進行篩選,STITCH和SwissTar get靶點最低得分閾值分別設(shè)為0.40和0.60。

        2.1.3UC相關(guān)靶點的收集 以“Ulcerative colitis”為檢索詞在PharmGKB、NCBI-gene、TTD、CTD和DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索,收集UC相關(guān)靶點。

        2.2網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

        2.2.1化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將2.1.2項下化學(xué)成分和靶點數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.6.1軟件實現(xiàn)GC化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的可視化,再將UC相關(guān)靶點映射至該網(wǎng)絡(luò),取交集,構(gòu)建GC治療UC的化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug likeness,DL)≥0.18進行二次篩選,獲得GC治療UC的潛在活性成分。

        2.2.2GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將二次篩選得到的UC相關(guān)靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),相互作用得分閾值設(shè)為0.4。利用Cytoscape 3.6.1軟件實現(xiàn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化,并利用MCODE聚類分析發(fā)現(xiàn)GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)。

        2.2.3GC治療UC關(guān)鍵靶點的識別 采用MCC(maximal clique centrality)、Degree(degree method)和EPC(edge percolated component)3種方法分別識別GC治療UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)中排名前10的關(guān)鍵靶點,取三者交集作為GC治療UC的關(guān)鍵靶點。

        2.2.4KEGG通路和GO生物學(xué)過程富集分析 通過CTD數(shù)據(jù)庫進行GO(gene ontology)生物學(xué)過程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)信號通路注釋分析,校正P值均設(shè)為0.05。

        3 結(jié)果

        3.1GC化學(xué)成分及其潛在作用靶點 采用UPLC/Q-TOF/MS從GC中鑒定出化學(xué)成分109種,主要包括黃酮類、萜類、香豆素和甾醇等,離子流圖見圖1。通過DrugBank、CTD、STITCH和SwissTarget 數(shù)據(jù)庫收集并預(yù)測109種化學(xué)成分的潛在作用靶點,共獲得靶點430個。

        圖1 UPLC/Q-TOF/MS離子流圖注: A.正離子;B.負離子。Fig.1 Total ion current diagramNotes:A.positive ion;B.negtive ion.

        3.2GC化學(xué)成分靶點與UC相關(guān)靶點的重合度 通過PharmGKB、NCBI-gene、TTD、CTD和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫,收集到UC相關(guān)靶點612個。對GC化學(xué)成分靶點與UC相關(guān)靶點進行一致性分析,發(fā)現(xiàn)GC中與UC相關(guān)的靶點有79個,占全部UC相關(guān)靶點的12.91%(79/612)。

        3.3化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 基于上述79個UC相關(guān)靶點構(gòu)建的GC治療UC化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)由110個節(jié)點和199條邊構(gòu)成,涉及化學(xué)成分31種,見圖2。圖中菱形和圓形節(jié)點分別表示GC化學(xué)成分和UC相關(guān)靶點,連線表示2個節(jié)點之間存在調(diào)控關(guān)系,多數(shù)成分都與多個靶點連接。以O(shè)B值≥30%且DL值≥0.18進行二次篩選,顯示naringenin、isoliquiritigenin、betulinic acid、licochalcone A、β-sitosterol、formononetin、8-prenylnaringenin、licoflavone B、licoflavone C、calycosin、glabranin、licopyranocoumarin和liquiritigenin可能參與對UC的調(diào)控,構(gòu)成GC治療UC的有效成分群。見表2。這13種潛在活性成分涉及AKT1、CASP9、BCL2、CASP3、ESR1、CYP1A1和CCND1等50個UC相關(guān)靶點,GC可能通過作用于這些靶點實現(xiàn)對UC的調(diào)控。

        表2 GC治療UC的潛在活性成分Tab.2 Potential active compounds in GC with UC ameliorative activity

        圖2 GC治療UC的化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Compound-target network in the treatment of UC by GC

        3.4GC治療UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò) 將GC調(diào)控UC的相關(guān)靶點映射至String數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建的GC治療UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)涉及節(jié)點49個,邊591條。之后,利用MCODE cluster聚類分析,識別出GC治療UC的核心網(wǎng)絡(luò)1個,該網(wǎng)絡(luò)由30個靶點組成,涉及邊376條,見圖3。圖中圓形節(jié)點表示GC參與調(diào)控UC的相關(guān)靶點,節(jié)點大小與其在網(wǎng)絡(luò)中的連通度呈正相關(guān),節(jié)點越大連通度越大,一定程度上表示其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。連線表示2個節(jié)點之間存在相互作用。

        圖3 GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Key protein-protein interaction network in the treatment of UC by GC

        3.5GC治療UC的關(guān)鍵靶點 基于MCC、Degree和EPC 3種方法,識別出GC治療UC的關(guān)鍵靶點8個,包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase B1,PKB1/AKT1)、白介素6(interleukin 6,IL6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、腫瘤蛋白p53(tumor protein 53,TP53)、半胱天冬酶3(caspase 3,CASP3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、白介素8(interleukin 8,CXCL8)和前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2),見圖4。這些靶點可能在GC治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。

        圖4 GC治療UC關(guān)鍵靶點的識別注:A.韋恩圖分析-MCC、Degree和 EPC;B.基于MCC的GC治療UC的關(guān)鍵靶點;C.基于Degree的GC治療UC的關(guān)鍵靶點;D.基于EPC的GC治療UC的關(guān)鍵靶點。Fig.4 Key targets in the treatment of UC by GCNotes:A.Venn diagram analysis-MCC,Degree,and EPC algorithms;B.key targets identified by MCC algorithm;C.key targets identified by Degree algorithm;D.key targets identified by EPC algorithm.

        3.6GC治療UC的潛在信號通路 基于3.4項下識別的GC治療UC的核心網(wǎng)絡(luò)進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),GC參與調(diào)控UC的相關(guān)通路共有24條,包括cancer、TNF、malaria、IL17、IBD、cytokine-cytokine receptor interaction、apoptosis、Jak-STAT、colorectal cancer、MAPK、NF-κB和HIF-1信號通路等,GC可能通過調(diào)控這些信號通路達到治療UC的目的。見表3。

        表3 GC治療UC的潛在通路Tab.3 Potential pathways involved in the treatment of UC by GC

        以Degree≥2 的前 9 位潛在活性成分構(gòu)建藥物-潛在活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò),從整體角度分析GC治療UC的生物學(xué)過程。整體網(wǎng)絡(luò)由61個節(jié)點和251條邊構(gòu)成,化學(xué)成分、靶點和信號通路的平均連通度分別為6.56、2.19和7.63,見圖5。圖中六角形、菱形、圓形和倒三角形節(jié)點分別表示中藥、中藥化學(xué)成分、化學(xué)成分靶點和KEGG信號通路。由圖5可見,GC可能通過naringenin、isoliquiritigenin、betulinic acid和licochalcone A等9種成分作用于AKT1、IL6、TNF等27個UC相關(guān)靶點,實現(xiàn)對cancer、TNF、malaria等24條信號通路的調(diào)控,從而發(fā)揮對UC的治療作用。

        圖5 GC治療UC的藥物-潛在活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Drug-compound-target-pathway association network in the treatment of UC by GC

        3.7GO生物過程富集分析 基于3.4項下識別的GC治療UC的核心網(wǎng)絡(luò)進行GO生物過程富集分析,共得到1 105個GO生物過程,依據(jù)P值升序排列,結(jié)果可見對含氧化合物的反應(yīng)、細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、細胞因子介導(dǎo)的通路、炎癥反應(yīng)、對外部刺激的反應(yīng)、細胞死亡調(diào)節(jié)和高分子代謝過程的正向調(diào)節(jié)等生物過程共20個GO生物過程位居前列。

        4 結(jié)論

        GC不僅對UC有治療作用,而且有預(yù)防UC向癌癥轉(zhuǎn)化的潛在價值。但是,GC活性成分不清、作用機制不明限制了其后續(xù)開發(fā)。因此,本研究基于多成分、多靶點思路,在系統(tǒng)分析GC化學(xué)成分的基礎(chǔ)上,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了GC治療UC的藥物-潛在活性成分-UC靶點網(wǎng)絡(luò),為后續(xù)研究提供線索。網(wǎng)絡(luò)分析篩選出的13種潛在活性成分中有9種屬于黃酮類,包括naringenin、isoliquiritigenin、licochalcone A、formononetin、8-prenylnaringenin、licoflavone B等,說明黃酮類在GC治療UC中發(fā)揮重要作用?;赟tring數(shù)據(jù)庫識別出的GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)由30個靶點組成,通過MCC、Degree和EPC 分析發(fā)現(xiàn),AKT1、IL6、TNF、TP53、CASP3、STAT3、CXCL8和PTGS2共8個關(guān)鍵靶點可能在GC治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。

        UC的發(fā)生、發(fā)展存在2個持續(xù)而重疊的過程,即炎癥反應(yīng)和腸道屏障損傷。IL6、TNF是UC 腸道炎癥中最典型的細胞因子[5-6]。IL6通過其受體傳遞信號,激活JAK,進而磷酸化STAT3,促進UC炎癥反應(yīng)。TNF通過活化NF-κB和MAPK通路,促進炎癥反應(yīng),破壞細胞間緊密連接,增加組織通透性,從而推動UC的發(fā)生、發(fā)展。KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示,IL6、TNF與TNF、malaria、IL17、IBD等信號通路有關(guān)。TNF信號通路:TNF→TNFR1→NF-κB、MAPK→IL6、IL1β;IL17信號通路:CD4+ T細胞等→IL17A、IL17C、IL17F→NF-κB、MAPK→IL6、IL1β、TNF;IBD信號通路:細菌、抗原等→NF-κB→JAK-STAT→IL10??梢奊C對IL6、IL1β和TNF等細胞因子的調(diào)控可以通過NF-κB和MAPK網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)。NF-κB信號通路在免疫細胞、上皮細胞炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用,能增加IL6、IL1β等細胞因子的釋放量,加速炎癥反應(yīng),從而促進UC發(fā)展。MAPK信號通路是調(diào)節(jié)正常細胞增殖、存活和分化的重要通路,ERK、JNK和p38激活,不僅可以促進炎性細胞因子的釋放,而且會引起腸黏膜屏障的損傷。

        AKT1既是炎性蛋白又是與結(jié)腸癌相關(guān)的致癌基因[7],是UC治療藥物間接作用的重要靶點[8]。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示,AKT1在GC治療UC的關(guān)鍵靶點中處于核心地位。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,AKT1參與的cancer信號通路是基因富集量最大的一條通路。AKT1還參與JAK-STAT、MAPK和PI3K-AKT信號通路,這些通路都與UC及相關(guān)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。JAK-STAT在UC結(jié)腸黏膜病變中發(fā)揮重要作用,研究證實以 JAK 抑制劑阻斷 JAK-STAT3通路對 UC 有治療效果[9-11]。MAPK信號通路激活是導(dǎo)致UC中促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放的主要因素之一,p38、ERK激活可調(diào)控下游NF-κB轉(zhuǎn)錄,影響IL6、TNF等的分泌[12-14]。PI3K/AKT信號通路同樣可以激活NF-κB,促進IL6、TNF等的釋放,加速炎癥反應(yīng),從而推動UC的發(fā)展[15-16],是治療UC的重要靶點。

        綜上所述,GC可能通過調(diào)控不同靶點作用于不同的信號通路,影響炎癥進程和保護腸道屏障,進而緩解 UC:①影響 IL6和TNF等細胞因子分泌,調(diào)節(jié)UC發(fā)生、發(fā)展中的免疫異常,穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境;②影響NF-κB、MAPK、JAK-STAT和PI3K-AKT網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)TNF、IL17和IBD等信號通路,抑制IL6、IL1β和TNF等細胞因子釋放,發(fā)揮抗炎作用;③調(diào)控MAPK和JAK/STAT 等網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮維護腸黏膜穩(wěn)態(tài)與損傷修復(fù)的作用,從而改善UC。

        值得注意的是,TP53也是GC治療UC的關(guān)鍵靶點之一。TP53突變在UC患者結(jié)腸炎癥組織中很常見,研究發(fā)現(xiàn),TP53第72位密碼子Arg/Arg基因型可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡促進UC發(fā)展,且該基因型的突變還會增加CAC的發(fā)生率[17]。Fujita M等報道,由UC發(fā)展而來的CAC患者中TP53的突變率高達78%[18]。因此,對TP53的有效干預(yù)不僅有助于治療UC,而且有利于預(yù)防CAC的發(fā)生。前期的研究證實,GC對CAC有預(yù)防作用,但到底是哪些成分在發(fā)揮作用,活性成分是否通過TP53發(fā)揮作用還不清楚。篩選GC中的活性成分,進而探討活性成分治療UC及預(yù)防炎-癌轉(zhuǎn)化的作用機制仍需要進一步研究。

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