張 娟，徐曉琴，王鈞篪，孫 宇，斯建勇*，卿德剛*(.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 0093；.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 83000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以潰瘍形成和慢性炎癥為主要病理特點(diǎn)的消化道疾病，病變多累及直腸和乙狀結(jié)腸，也可遍及整個(gè)結(jié)腸。UC的發(fā)作期與緩解期反復(fù)交替，病程冗長(zhǎng)，難治愈，復(fù)發(fā)率高，并且超過20%的患者會(huì)在30年內(nèi)發(fā)展為致死率高達(dá)50%的炎癥性結(jié)腸癌(colitis-associated cancer，CAC)[1]。目前，尚無(wú)有效治療UC的手段，更無(wú)有效預(yù)防UC炎-癌轉(zhuǎn)化的手段，開發(fā)高效、低毒的治療UC和預(yù)防UC向癌癥發(fā)展的活性成分仍然是十分必要的。

前期的研究證實(shí)，來(lái)源于甘草渣的活性部位(GC)可以通過干預(yù)在UC發(fā)生、發(fā)展中起中心調(diào)控作用的NF-кB通路發(fā)揮抗炎作用，通過干預(yù)Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用，從而對(duì)UC起到治療作用[2-3]，并且其對(duì)CAC也有緩解作用[4]，具有較大開發(fā)價(jià)值。GC雖然是經(jīng)過富集的活性部位，但是其化學(xué)成分仍然復(fù)雜，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制都不清楚。因此，本研究在應(yīng)用UPLC/Q-TOF/MS系統(tǒng)分析GC化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)GC治療UC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，建立潛在活性成分-靶點(diǎn)-通路的關(guān)系，探究GC治療UC的多成分、多靶點(diǎn)和多途徑作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色譜儀(日本SHIMAZU公司)；Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)；Heraeus Fresco 17離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；BSA124S-CW電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；YM-080S超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱。

1.2試藥 GC樣品為自制；甲醇、乙腈、甲酸均為L(zhǎng)C-MS級(jí)，均購(gòu)自德國(guó)CNW公司。

2 方法

2.1數(shù)據(jù)來(lái)源

2.1.1GC化學(xué)成分鑒定 精密稱定0.1 g GC樣品，以體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇3 mL超聲溶解。色譜柱為UPLC BEH C18，流動(dòng)相為1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，進(jìn)樣量5 μL，洗脫條件見表1。質(zhì)譜儀：轟擊能量40 eV，碰撞能差20 V。ESI離子源：霧化氣壓55 psi，輔助氣壓55 psi，氣簾氣壓35 psi，550 ℃，噴霧電壓5 500 V(正離子模式)或-4 000 V(負(fù)離子模式)。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

2.1.2GC潛在靶點(diǎn)的收集與預(yù)測(cè) 通過DrugBank、CTD、STITCH和SwissTarget數(shù)據(jù)庫(kù)收集并預(yù)測(cè)GC各化學(xué)成分的靶點(diǎn)，進(jìn)而依據(jù)靶點(diǎn)得分進(jìn)行篩選，STITCH和SwissTar get靶點(diǎn)最低得分閾值分別設(shè)為0.40和0.60。

2.1.3UC相關(guān)靶點(diǎn)的收集 以“Ulcerative colitis”為檢索詞在PharmGKB、NCBI-gene、TTD、CTD和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，收集UC相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.2.1化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將2.1.2項(xiàng)下化學(xué)成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.6.1軟件實(shí)現(xiàn)GC化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的可視化，再將UC相關(guān)靶點(diǎn)映射至該網(wǎng)絡(luò)，取交集，構(gòu)建GC治療UC的化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug likeness，DL)≥0.18進(jìn)行二次篩選，獲得GC治療UC的潛在活性成分。

2.2.2GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將二次篩選得到的UC相關(guān)靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，相互作用得分閾值設(shè)為0.4。利用Cytoscape 3.6.1軟件實(shí)現(xiàn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化，并利用MCODE聚類分析發(fā)現(xiàn)GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)。

2.2.3GC治療UC關(guān)鍵靶點(diǎn)的識(shí)別 采用MCC(maximal clique centrality)、Degree(degree method)和EPC(edge percolated component)3種方法分別識(shí)別GC治療UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)中排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)，取三者交集作為GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2.4KEGG通路和GO生物學(xué)過程富集分析 通過CTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO(gene ontology)生物學(xué)過程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)信號(hào)通路注釋分析，校正P值均設(shè)為0.05。

3 結(jié)果

3.1GC化學(xué)成分及其潛在作用靶點(diǎn) 采用UPLC/Q-TOF/MS從GC中鑒定出化學(xué)成分109種，主要包括黃酮類、萜類、香豆素和甾醇等，離子流圖見圖1。通過DrugBank、CTD、STITCH和SwissTarget 數(shù)據(jù)庫(kù)收集并預(yù)測(cè)109種化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)，共獲得靶點(diǎn)430個(gè)。

圖1 UPLC/Q-TOF/MS離子流圖注： A.正離子；B.負(fù)離子。Fig.1 Total ion current diagramNotes:A.positive ion；B.negtive ion.

3.2GC化學(xué)成分靶點(diǎn)與UC相關(guān)靶點(diǎn)的重合度 通過PharmGKB、NCBI-gene、TTD、CTD和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，收集到UC相關(guān)靶點(diǎn)612個(gè)。對(duì)GC化學(xué)成分靶點(diǎn)與UC相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行一致性分析，發(fā)現(xiàn)GC中與UC相關(guān)的靶點(diǎn)有79個(gè)，占全部UC相關(guān)靶點(diǎn)的12.91%(79/612)。

3.3化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 基于上述79個(gè)UC相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建的GC治療UC化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由110個(gè)節(jié)點(diǎn)和199條邊構(gòu)成，涉及化學(xué)成分31種，見圖2。圖中菱形和圓形節(jié)點(diǎn)分別表示GC化學(xué)成分和UC相關(guān)靶點(diǎn)，連線表示2個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在調(diào)控關(guān)系，多數(shù)成分都與多個(gè)靶點(diǎn)連接。以O(shè)B值≥30%且DL值≥0.18進(jìn)行二次篩選，顯示naringenin、isoliquiritigenin、betulinic acid、licochalcone A、β-sitosterol、formononetin、8-prenylnaringenin、licoflavone B、licoflavone C、calycosin、glabranin、licopyranocoumarin和liquiritigenin可能參與對(duì)UC的調(diào)控，構(gòu)成GC治療UC的有效成分群。見表2。這13種潛在活性成分涉及AKT1、CASP9、BCL2、CASP3、ESR1、CYP1A1和CCND1等50個(gè)UC相關(guān)靶點(diǎn)，GC可能通過作用于這些靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)UC的調(diào)控。

表2 GC治療UC的潛在活性成分Tab.2 Potential active compounds in GC with UC ameliorative activity

圖2 GC治療UC的化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Compound-target network in the treatment of UC by GC

3.4GC治療UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò) 將GC調(diào)控UC的相關(guān)靶點(diǎn)映射至String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建的GC治療UC蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)涉及節(jié)點(diǎn)49個(gè)，邊591條。之后，利用MCODE cluster聚類分析，識(shí)別出GC治療UC的核心網(wǎng)絡(luò)1個(gè)，該網(wǎng)絡(luò)由30個(gè)靶點(diǎn)組成，涉及邊376條，見圖3。圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示GC參與調(diào)控UC的相關(guān)靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小與其在網(wǎng)絡(luò)中的連通度呈正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)越大連通度越大，一定程度上表示其在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。連線表示2個(gè)節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用。

圖3 GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Key protein-protein interaction network in the treatment of UC by GC

3.5GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn) 基于MCC、Degree和EPC 3種方法，識(shí)別出GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)8個(gè)，包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase B1，PKB1/AKT1)、白介素6(interleukin 6，IL6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、腫瘤蛋白p53(tumor protein 53，TP53)、半胱天冬酶3(caspase 3，CASP3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、白介素8(interleukin 8，CXCL8)和前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)，見圖4。這些靶點(diǎn)可能在GC治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。

圖4 GC治療UC關(guān)鍵靶點(diǎn)的識(shí)別注：A.韋恩圖分析-MCC、Degree和 EPC；B.基于MCC的GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)；C.基于Degree的GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)；D.基于EPC的GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。Fig.4 Key targets in the treatment of UC by GCNotes:A.Venn diagram analysis-MCC，Degree，and EPC algorithms;B.key targets identified by MCC algorithm;C.key targets identified by Degree algorithm;D.key targets identified by EPC algorithm.

3.6GC治療UC的潛在信號(hào)通路 基于3.4項(xiàng)下識(shí)別的GC治療UC的核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，GC參與調(diào)控UC的相關(guān)通路共有24條，包括cancer、TNF、malaria、IL17、IBD、cytokine-cytokine receptor interaction、apoptosis、Jak-STAT、colorectal cancer、MAPK、NF-κB和HIF-1信號(hào)通路等，GC可能通過調(diào)控這些信號(hào)通路達(dá)到治療UC的目的。見表3。

表3 GC治療UC的潛在通路Tab.3 Potential pathways involved in the treatment of UC by GC

以Degree≥2 的前 9 位潛在活性成分構(gòu)建藥物-潛在活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，從整體角度分析GC治療UC的生物學(xué)過程。整體網(wǎng)絡(luò)由61個(gè)節(jié)點(diǎn)和251條邊構(gòu)成，化學(xué)成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路的平均連通度分別為6.56、2.19和7.63，見圖5。圖中六角形、菱形、圓形和倒三角形節(jié)點(diǎn)分別表示中藥、中藥化學(xué)成分、化學(xué)成分靶點(diǎn)和KEGG信號(hào)通路。由圖5可見，GC可能通過naringenin、isoliquiritigenin、betulinic acid和licochalcone A等9種成分作用于AKT1、IL6、TNF等27個(gè)UC相關(guān)靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)cancer、TNF、malaria等24條信號(hào)通路的調(diào)控，從而發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。

圖5 GC治療UC的藥物-潛在活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Drug-compound-target-pathway association network in the treatment of UC by GC

3.7GO生物過程富集分析 基于3.4項(xiàng)下識(shí)別的GC治療UC的核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO生物過程富集分析，共得到1 105個(gè)GO生物過程，依據(jù)P值升序排列，結(jié)果可見對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的通路、炎癥反應(yīng)、對(duì)外部刺激的反應(yīng)、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)和高分子代謝過程的正向調(diào)節(jié)等生物過程共20個(gè)GO生物過程位居前列。

4 結(jié)論

GC不僅對(duì)UC有治療作用，而且有預(yù)防UC向癌癥轉(zhuǎn)化的潛在價(jià)值。但是，GC活性成分不清、作用機(jī)制不明限制了其后續(xù)開發(fā)。因此，本研究基于多成分、多靶點(diǎn)思路，在系統(tǒng)分析GC化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了GC治療UC的藥物-潛在活性成分-UC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)研究提供線索。網(wǎng)絡(luò)分析篩選出的13種潛在活性成分中有9種屬于黃酮類，包括naringenin、isoliquiritigenin、licochalcone A、formononetin、8-prenylnaringenin、licoflavone B等，說明黃酮類在GC治療UC中發(fā)揮重要作用?；赟tring數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別出的GC治療UC的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)由30個(gè)靶點(diǎn)組成，通過MCC、Degree和EPC 分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、IL6、TNF、TP53、CASP3、STAT3、CXCL8和PTGS2共8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)可能在GC治療UC的過程中發(fā)揮重要作用。

UC的發(fā)生、發(fā)展存在2個(gè)持續(xù)而重疊的過程，即炎癥反應(yīng)和腸道屏障損傷。IL6、TNF是UC 腸道炎癥中最典型的細(xì)胞因子[5-6]。IL6通過其受體傳遞信號(hào)，激活JAK，進(jìn)而磷酸化STAT3，促進(jìn)UC炎癥反應(yīng)。TNF通過活化NF-κB和MAPK通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，破壞細(xì)胞間緊密連接，增加組織通透性，從而推動(dòng)UC的發(fā)生、發(fā)展。KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示，IL6、TNF與TNF、malaria、IL17、IBD等信號(hào)通路有關(guān)。TNF信號(hào)通路：TNF→TNFR1→NF-κB、MAPK→IL6、IL1β；IL17信號(hào)通路：CD4+ T細(xì)胞等→IL17A、IL17C、IL17F→NF-κB、MAPK→IL6、IL1β、TNF；IBD信號(hào)通路：細(xì)菌、抗原等→NF-κB→JAK-STAT→IL10?？梢奊C對(duì)IL6、IL1β和TNF等細(xì)胞因子的調(diào)控可以通過NF-κB和MAPK網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)。NF-κB信號(hào)通路在免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用，能增加IL6、IL1β等細(xì)胞因子的釋放量，加速炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)UC發(fā)展。MAPK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖、存活和分化的重要通路，ERK、JNK和p38激活，不僅可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，而且會(huì)引起腸黏膜屏障的損傷。

AKT1既是炎性蛋白又是與結(jié)腸癌相關(guān)的致癌基因[7]，是UC治療藥物間接作用的重要靶點(diǎn)[8]。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，AKT1在GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)中處于核心地位。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，AKT1參與的cancer信號(hào)通路是基因富集量最大的一條通路。AKT1還參與JAK-STAT、MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路，這些通路都與UC及相關(guān)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。JAK-STAT在UC結(jié)腸黏膜病變中發(fā)揮重要作用，研究證實(shí)以 JAK 抑制劑阻斷 JAK-STAT3通路對(duì) UC 有治療效果[9-11]。MAPK信號(hào)通路激活是導(dǎo)致UC中促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放的主要因素之一，p38、ERK激活可調(diào)控下游NF-κB轉(zhuǎn)錄，影響IL6、TNF等的分泌[12-14]。PI3K/AKT信號(hào)通路同樣可以激活NF-κB，促進(jìn)IL6、TNF等的釋放，加速炎癥反應(yīng)，從而推動(dòng)UC的發(fā)展[15-16]，是治療UC的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，GC可能通過調(diào)控不同靶點(diǎn)作用于不同的信號(hào)通路，影響炎癥進(jìn)程和保護(hù)腸道屏障，進(jìn)而緩解 UC：①影響 IL6和TNF等細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)UC發(fā)生、發(fā)展中的免疫異常，穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境；②影響NF-κB、MAPK、JAK-STAT和PI3K-AKT網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)TNF、IL17和IBD等信號(hào)通路，抑制IL6、IL1β和TNF等細(xì)胞因子釋放，發(fā)揮抗炎作用；③調(diào)控MAPK和JAK/STAT 等網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮維護(hù)腸黏膜穩(wěn)態(tài)與損傷修復(fù)的作用，從而改善UC。

值得注意的是，TP53也是GC治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。TP53突變?cè)赨C患者結(jié)腸炎癥組織中很常見，研究發(fā)現(xiàn)，TP53第72位密碼子Arg/Arg基因型可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)UC發(fā)展，且該基因型的突變還會(huì)增加CAC的發(fā)生率[17]。Fujita M等報(bào)道，由UC發(fā)展而來(lái)的CAC患者中TP53的突變率高達(dá)78%[18]。因此，對(duì)TP53的有效干預(yù)不僅有助于治療UC，而且有利于預(yù)防CAC的發(fā)生。前期的研究證實(shí)，GC對(duì)CAC有預(yù)防作用，但到底是哪些成分在發(fā)揮作用，活性成分是否通過TP53發(fā)揮作用還不清楚。篩選GC中的活性成分，進(jìn)而探討活性成分治療UC及預(yù)防炎-癌轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。