高志剛， 羅 勇， 鄧權鋒， 李曉瑞， 李廣哲

（大連理工大學國家級化工綜合實驗教學中心，遼寧大連116024）

0 引 言

生物打印是近幾年來在組織工程領域的新興技術，是根據(jù)分散堆積成形原理，以活細胞、生物活性因子為原材料，設計打印出具有生物活性的人工器官或組織結(jié)構(gòu)的技術，融合了制造技術與生物醫(yī)學等學科［1-3］。生物打印與傳統(tǒng)的制造方法（如圖案法、模具法等）相比，其主要的優(yōu)勢體現(xiàn)在：不依賴模具而進行生物體的制造，不受傳統(tǒng)加工的限制，可以構(gòu)建復雜的結(jié)構(gòu)體，將多種細胞精準空間排列，不產(chǎn)生廢料而做到節(jié)省材料，不占用空間，節(jié)約時間等方面［4-6］。

生物3D打印機的搭建組裝是生物制造的重要條件，但也面臨著很多挑戰(zhàn)，如打印機構(gòu)建、打印方式確定和打印后組織的評價都要結(jié)合活性細胞性質(zhì)而設計，涵蓋細胞學、材料學、機械自動化等諸多學科的知識。目前生物3D 打印機的搭建技術并不十分成熟，由于打印的細胞種類、生物墨水材料和打印后驗證手段不同，全球僅有美國、德國等少數(shù)幾個國家有能力研發(fā)生產(chǎn)商品化的生物打印機，但受制于價格較高及軟硬件參數(shù)受專利保護無法修改，商品化的生物打印機在國內(nèi)還未得到大量的應用［7］。為了開發(fā)更加實用生物打印機，促進生物打印技術在科研和教育領域的發(fā)展，本文構(gòu)造了可以進行低溫控制、集成化、體積小的擠壓型生物打印機，并對打印參數(shù)和效果進行了測試，可完全滿足生物打印要求。

1 生物打印原理

逐層累加細胞打印組織的需求在醫(yī)藥生物發(fā)展中已逐漸擴大，但打印細胞和組織需要較高性能的打印平臺為細胞無菌增殖創(chuàng)造條件；同時生物打印還需要具有生物相容性的遞送介質(zhì)，可以按計算機輔助設計建模的要求打印出具體形狀［8］。因此生物打印主要涉及打印模式的搭建與兼容適配，打印材料的性質(zhì)穩(wěn)定易加工，且具有較好的生物相容性。目前生物打印機根據(jù)打印原理分別是擠出式、噴墨式和激光式生物打印機。

1.1 基于激光技術

基于激光技術的生物打印機利用激光能量將細胞從捐助者的幻燈片沉積到接收器幻燈片，而不需要噴嘴，該技術源于激光誘導方位轉(zhuǎn)移原理，2001 年由密歇根理工大Odde 教授提出，但是該技術打印的生物墨水要求黏度范圍在1 ～300 mPa／s。該技術生物打印精度高，但打印過程復雜容易出現(xiàn)打印故障，且打印成本很高［9-11］。

1.2 基于噴墨技術

基于噴墨方式的生物打印機利用熱壓或超聲驅(qū)動機制以高通量方式沉積細胞懸液液滴；最初的噴墨式生物打印被命名為“細胞劃線”，因為二維打印的墨水的液滴大小類似于生物制劑。較早出現(xiàn)的噴墨打印平臺只可打印黏度為10 mPa／s 以下的生物墨水。若黏度較大則對擠壓力要求更多，會傷害細胞膜，故要求細胞密度小于107個／mL，打印過程采用的光交聯(lián)方式可能會損傷細胞，且打印時間較長［12］。

1.3 基于擠出技術

基于擠壓方式的生物打印機使用機械或氣動驅(qū)動系統(tǒng)，以擠出生物墨水細絲的形式逐層沉積細胞，打印機硬件系統(tǒng)由擠出動力系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)等組成?？纱蛴〖毎呙芏鹊纳锬ざ确秶鸀椋? ～6）×102Pa／s 的生物相容性材料均適用于擠壓式生物3D打印機。但細胞存活率稍低，只有40% ～80%，且隨著擠壓力變大和注射器針口直徑的縮小，細胞活性會相對降低低［13-14］。目前擠壓式生物打印機主要分為五類：常規(guī)的擠壓生物打印機；具有較高運動自由度的擠壓生物打印機；支持生物細胞基質(zhì)過程的生物打印機；支持生物打印細胞聚集體的生物打印機；支持其他生物打印模式的生物打印機。

2 生物打印機設計與搭建

本文所搭建的擠出型打印機如圖1 所示，主要由模型設計軟件、中央控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、打印底板、打印頭和三維運動平臺六部分組成。

圖1 擠出型3D生物打印機系統(tǒng)構(gòu)建

2.1 模型設計軟件

三維設計軟件主要用到Autodesk 3DS Max 軟件和Repetier-Host 切片軟件，前者用于模型構(gòu)建，而后者是3D 打印技術的核心軟件，通過把三維的立體模型分成無數(shù)個層層的二維平面，再由打印機還原，即使用軟件實現(xiàn)點和線向空間中的坐標的構(gòu)建的轉(zhuǎn)化，就是常說的G 代碼。切片軟件對打印速度、填充效率和打印層次數(shù)等相關參數(shù)都可以做到數(shù)字化可控，以及確定的G 代碼就可以實現(xiàn)三維打印。

2.2 控制系統(tǒng)

3D 打印機中最關鍵的運行部件是單片機，如常見的mage2560 ＋ramps1.4 分體板、ultimaker2 主板、3dymy ramps plus2。本打印機控制系統(tǒng)設計如圖2 所示，選擇mage2560 ＋ramps1.4 分體板作為核心控制器，設置16 細分的電機細分數(shù)。與此同時，為了達到提高人機交互和可視化控制的效率的目標，打印機還選擇在工業(yè)中常用的電阻式觸摸屏，從而使得打印機進行離線操作。

2.3 溫度控制系統(tǒng)

溫度系統(tǒng)作為生物打印機主要控制單元，決定著生物墨水的打印性質(zhì)和生物相容性是否適用于細胞三維培養(yǎng)。根據(jù)目前商用打印機調(diào)研得出，溫控主要由加熱片及氣源泵組成，較為笨重且費用占比過大。本打印機設計主要從溫度集成入手，根據(jù)添加散熱片和半導體加熱片的途徑，在主機內(nèi)進行集成，從控制臺進行溫控設置，為避免切片軟件設計時的溫控參數(shù)對改進后的控制臺溫度影響，在兩個接入面板將溫控信號傳導進行了焊點阻斷，調(diào)試出了合理的擠出頭和底板溫控系統(tǒng)。

圖2 生物打印控制系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

2.4 打印底板

打印底板可以進行十分精細的調(diào)節(jié)，達到調(diào)節(jié)打印噴頭和底板間的距離的作用，如圖3 所示。考慮生物墨水特性，用半導體制冷技術在底板下增加一套控溫系統(tǒng)，底板上裝有凹槽，可直接將細胞組織結(jié)構(gòu)貼到凹槽中固定的玻璃片上。

圖3 打印底板實物圖

2.5 打印噴頭

生物打印機的打印噴頭稱為注射器的“注射泵”，注射器擠出生物材料，再受到了滑塊的運動刺激。目前存在兩種擠壓動力，即氣動擠壓和電動擠壓。氣動擠壓頭用高壓氣體促使凝膠運動，組成系統(tǒng)要求一定的氣密性和及時的空氣過濾，組成系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)比較復雜，氣動泵，調(diào)壓閥，電磁開關，劣勢明顯，匹配的速度慢，打印精度低等。

因此，本機選擇使用電動式擠出頭，與注射泵原理類似，在注射器里添加生物墨水，受到來自步進電動機或伺服電動機的驅(qū)動，使得生物墨水精密準確地擠出，這種系統(tǒng)具有超高的精度、超快的反應速度、較小的個體等優(yōu)勢。圖4 中展示的是對具有溫度控制能力的打印頭的設計，打印噴頭設計了溫度控制模塊，可控溫度范圍為5 ～100 ℃。同時圖4（c）中注射器外設計夾套，夾套配有半導體制冷片、散熱片、散熱風扇等控制注射器溫度，并以此調(diào)節(jié)生物墨水的黏彈性。

圖4 生物打印噴頭設計圖（（a）夾套設計CAD 圖，（b）打印頭溫控系統(tǒng)圖，（c）打印噴頭實物圖）

2.6 三維運動平臺

三維運動平臺是3D 打印機中的重要組成部分，主要存在的結(jié)構(gòu)類型有并聯(lián)結(jié)構(gòu)型、Prusa i3 型和串聯(lián)結(jié)構(gòu)型等，可以對噴頭在空間的移動的一致性進行共同協(xié)調(diào)。運動平臺主要由X、Y、Z 3 個主傳動軸和E1、E2 兩個步進電軸組成，用電鉆在打印機主骨架橫梁中點鉆出X、Y、Z 3 個方向的垂直圓孔，務必保持重心一致以保持后續(xù)運動平衡，其連接主要靠螺帽固定，內(nèi)側(cè)套好3 個42 步進電動機和彈簧片，對線性軸承模組進行固定，同時在X、Y、Z軸分別添加了可調(diào)節(jié)的限位開關，便于根據(jù)不同要求調(diào)整打印機高度。

3 生物打印人耳軟骨細胞

3.1 生物墨水制備

如何利用打印機打印具有良好組織結(jié)構(gòu)的生物模型，性能完善的生物墨水是必須條件。根據(jù)生物墨水要求的機械性能、生物相容性、黏彈性、剪切變稀性等特點［15-16］，確定了基于黏土、海藻酸鈉、硫酸鈣交聯(lián)劑、硅橡膠黏合劑、固化劑這5 種原料的生物墨水配制方式，本文就這5 種生物墨水原料的配比進行了探索，其中海藻酸鈉與交聯(lián)劑的配比為2∶1，硅橡膠與固化劑比例為20∶1。在此前條件下，要保證實驗墨水總量不超過5 mL，依據(jù)打印出的耳朵模型結(jié)構(gòu)保存時間來評價配比是否完善。實驗結(jié)果如表1 所示，由此確定生物墨水配比為3 g 黏土、2 mL 海藻酸鈉、1 mL 硫酸鈣交聯(lián)劑、4 mL硅橡膠、0.2 mL固化劑。

3.2 軟骨細胞培養(yǎng)

本實驗選擇來自北納創(chuàng)聯(lián)公司的C28／I2 細胞，屬于人正常軟骨細胞，該細胞的培養(yǎng)液為90 %高糖DMEM／F-12 ＋10%FBS ＋1%雙抗。

表1 生物墨水主要成分配比

人耳模型打印一般在細胞消化后，將培養(yǎng)2 d 鋪滿皿底的細胞消化下來轉(zhuǎn)移入5 mL 離心管中，在1 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心4 min，離心后將上層細胞清液吸取，加入200 μL細胞培養(yǎng)液反復沖洗，制成細胞懸液。吸取2 mL配制好的生物墨水置于5 mL 注射器中，將200 μL細胞懸液滴入注射器中，反復吹打混勻100 次以上，使生物墨水混合均勻。打開溫度控制系統(tǒng)，設置為底板13 ℃，注射器夾套溫度15 ℃，安裝好注射器冷卻15 min，調(diào)節(jié)注射器回原點，旋下Z 軸將注射器中的墨水擠出少許，調(diào)底板高度距針頭約0.5 mm，選擇文件模型進行打印。

人耳模型打印完成后連同玻璃片取出，滴加配制好的氯化鈣溶液進行交聯(lián)15 min，同時培養(yǎng)皿中加入8 mL無血清的空培養(yǎng)液和2 mL 氯化鈣溶液，將交聯(lián)后的人耳模型轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于搖床上搖動5 min，將皿內(nèi)液體吸去，再加入10 mL 空培養(yǎng)液搖床搖動5 min，反復3 次。最終吸棄小皿里的空培養(yǎng)液，加入預先配制好的細胞培養(yǎng)液，沒過打印出耳朵，放于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3.3 打印軟骨細胞活性表征

打印好的人耳組織模型主要從外觀結(jié)構(gòu)和熒光染色進行表征。外觀結(jié)構(gòu)每隔2 d 觀察人耳模型結(jié)構(gòu)，查看在培養(yǎng)液下的外觀狀態(tài)并進行拍照對比，如圖5所示，打印后的形狀維持時間可達10 d。

圖5 打印含有軟骨細胞的人耳模型10 d內(nèi)觀察圖

熒光染色主要考察三維培養(yǎng)條件下軟骨細胞的活死，主要用到鈣黃綠素和碘化吡啶作為染色劑進行活死檢測，首先將染色劑在避光的條件下高速離心，取樣品切碎幾個斷面于培養(yǎng)皿中吸取300 μL培養(yǎng)液，分別加入兩種染色劑各1.5 μL，注意每次一定要更換槍頭，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 后進行漂洗，加入空培養(yǎng)液1 ～2 mL，在搖床上搖動5 min，反復3 次，貼上封口膜轉(zhuǎn)移入細胞間進行熒光拍照，結(jié)果如圖6 所示?？梢园l(fā)現(xiàn)生物打印后的軟骨細胞在三維模型中能保持正常增殖功能，且隨著時間增加，細胞數(shù)量逐漸增多。

圖6 活細胞熒光染色結(jié)果圖

4 結(jié) 語

隨著新的打印技術和生物材料不斷應用，使得生物打印技術已經(jīng)逐漸成熟。與此同時受制于打印機價格昂貴，操作復雜，使得該技術普遍推廣較為困難。本文研制了一個擠出型生物打印機并成功構(gòu)建出含有軟骨細胞的人耳三維模型，打印后的細胞展現(xiàn)出良好生物活性，為后續(xù)生物工程、組織工程和藥學等專業(yè)實驗教學提供了良好的借鑒。該生物打印機具有較高的集成性，操作簡便，價格便宜，并基于溫敏性生物墨水實現(xiàn)打印。通過該生物打印機的研制，能夠促進了生物打印技術在高等教育教學領域的應用和推廣。