王貴玲，洪 滔，淦 岷，仇麗鴻

腫瘤或炎癥等骨破壞性疾病可能引起牙槽骨較大面積骨缺損，往往需要外界干預(yù)。缺損區(qū)成骨細胞對微環(huán)境的改變很敏感，又是直接調(diào)節(jié)骨形成的重要細胞，所以它的生物活性在骨組織修復(fù)中具有重要作用[1]。如何充分調(diào)動缺損區(qū)成骨細胞生物活性對骨缺損的修復(fù)再生具有重要意義。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，在骨缺損修復(fù)治療中療效顯著[2-3]。早期人們認為MSCs主要作為組織修復(fù)中的種子細胞，利用其成骨分化能力發(fā)揮作用，但近年來研究結(jié)果顯示MSCs并非直接參與組織修復(fù)的主要細胞，而是主要通過分泌相關(guān)生物活性因子，改變機體局部微環(huán)境，即通過旁分泌機制誘導(dǎo)機體自身細胞歸巢并調(diào)節(jié)細胞增殖分化，進而發(fā)揮對骨組織的修復(fù)作用[4-5]。人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)因取材方便，且無倫理限制，成為MSCs理想的細胞來源[6-7]。本研究通過收集人羊膜間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(condition medium，hAMSCs-CM)并作用于人成骨樣細胞系MG63，進而研究hAMSCs對成骨細胞的旁分泌作用，為hAMSCs在牙槽骨再生修復(fù)中的進一步應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)，低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國)，膠原蛋白酶Ⅳ、pNPP試劑盒(Sigma，美國)，胰蛋白酶(Sangon，中國)，MTT試劑盒(Invitrogen，美國)，CD29、CD105、CD44、CD45、CD31、CD49d、SSEA3、SSEA4、CD34、HLADR抗體(BD Pharmingen，美國)，BCA試劑盒(碧云天，中國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人成骨樣細胞系MG63細胞(購自中國科學(xué)院細胞庫)，用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細胞融合度達90%后按4×104個/cm2傳代。

1.3 hAMSCs原代提取

羊膜樣本由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科提供，產(chǎn)前檢測無傳染性疾病，并經(jīng)產(chǎn)婦知情同意。在胎盤娩出10 min內(nèi)，從胎盤上鈍性分離羊膜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗后，浸泡于含1 000 U/mL慶大霉素和2.5 μg/mL 二性霉素B的PBS中，冰盒2 h內(nèi)運至實驗室。剪取面積約5 cm×5 cm大小羊膜，刮凈表面的絨毛膜及殘留血塊，放入離心管中，加入約20 mL的0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化20 min兩次，后剪碎放入離心管中，加入10 mL 1 g/L的膠原蛋白酶Ⅳ，37 ℃水浴約60 mim，200目不銹鋼網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min，可觀察到細胞沉淀即為hAMSCs。用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液將細胞沉淀重懸并接種，第二天可觀察細胞貼附情況，1～2 d后換液，長滿后傳代,之后換用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的第3～5代hAMSCs進行后續(xù)實驗。

1.4 流式鑒定原代hAMSCs細胞表面標記物表達

取第4代hAMSCs，消化離心后冷PBS清洗2次，加100 μL冷PBS重懸細胞，細胞數(shù)不少于5×105個/管，每管各加5 μL細胞表面標記物抗體，分別為CD29、CD105、CD44、CD49d、SSEA3、SSEA4、CD34、HLADR，另設(shè)空白對照，冰上避光孵育30 min，洗滌2次后300 μL PBS重懸細胞沉淀，換用流式管，流式檢測儀檢測。

1.5 收取hAMSC-CM

取第3～5代hAMSCs，待其細胞融合度達90%左右時，換用新鮮培養(yǎng)液，24 h后收取培養(yǎng)上清，1 500 r/min離心5 min去沉淀后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?，與新鮮培養(yǎng)液1∶1混合后作為hAMSC-CM用于后續(xù)實驗，并以新鮮培養(yǎng)液作為陰性對照組。

1.6 MTT檢測hAMSC-CM對MG63增殖的影響

MG63按2×103個/孔接種于96孔板中，第2天換用hAMSC-CM，之后1～4 d內(nèi)每隔24 h MTT法檢測細胞增殖活力。按試劑說明書操作，1.5 h后酶標儀490 nm波長下檢測光密度(OD值)。

1.7 Transwell檢測hAMSC-CM對MG63遷移的影響

MG63消化離心后按1×106個/mL重懸于不含血清培養(yǎng)基中，選用24孔板Transwell小室，下室加入600 μL hAMSC-CM，取100 μL細胞懸液(約1×105個)置于上室，觀察無氣泡后放回細胞培養(yǎng)箱。2.5 h后甲醇固定1 min，蘇木精-伊紅染色，棉花棒擦去小室上層細胞，晾干后顯微鏡下隨機取7個視野拍照并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.8 pNPP法檢測細胞內(nèi)ALP表達活性

MG63融合度達90%后，換用hAMSC-CM，5 d后，pNPP法檢測細胞內(nèi)ALP表達[8]。每孔加40 μL RIPA(加蛋白酶抑制劑PMSF)裂解細胞提取細胞質(zhì)蛋白。取10 μL蛋白裂解液于96孔微板中，另加90 μL pNPP溶液，迅速酶標儀405 nm波長下檢測各孔OD值作為Ainitial。37 ℃溫箱中孵育tx=30 min后再次檢測405 nm波長下OD值作為Afinal。按公式計算ALP活性：ALP 活性=10×((Afinal-Ainitial)/tx) ×R/18.45(其中10代表稀釋倍數(shù)；R為路徑長度，在96孔板、100 μL反應(yīng)體系中約為0.31 cm；18.45代表消光系數(shù))。

同時取1 μL蛋白裂解液，按BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度(mg/mL)，最后將計算得到的ALP活性除以蛋白量后得到標準化的ALP活性(U/g)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示，SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hAMSCs表面標志物鑒定

hAMSCs呈典型的成纖維樣細胞形態(tài)，漩渦狀生長(圖1A)。流式結(jié)果(圖1B)顯示，人羊膜間充質(zhì)干細胞陽性表達CD29、CD105、CD49d、CD44；陰性表達CD34、CD45、CD31和HLADR，表明hAMSCs具有間充質(zhì)干細胞一般特性。

A:hAMSCs形態(tài)觀察( ×100)；B: 流式細胞儀檢測hAMSCs表面標志物表達圖1 hAMSCs細胞鑒定Fig.1 Identification of hAMSCs

2.2 hAMSC-CM對MG63增殖能力的影響

hAMSC-CM作用于MG63后，與陰性對照組相比，連續(xù)3 d均可顯著促進細胞增殖(P<0.05)，第4天時，細胞增殖增加無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(圖2)。

2.3 hAMSC-CM對MG63遷移能力的影響

Transwell遷移模型2.5 h后，hAMSC-CM組MG63遷移細胞計數(shù)為117.60±14.54，顯著高于對照組的20.20±10.38，表明hAMSC-CM可顯著增強MG63遷移能力(P<0.05)(圖3)。

2.4 hAMSCs-CM對MG63細胞ALP活性的影響

hAMSCs-CM連續(xù)培養(yǎng)MG63細胞5 d后，細胞內(nèi)ALP表達明顯強于對照組(P<0.05)(圖4)，提示hAMSCs-CM可顯著促進MG63細胞成骨分化。

與對照組比較，*：P<0.05圖2 hAMSC-CM對MG63增殖能力的影響Fig.2 Effect of hAMSC-CM on MG63 cell proliferation

A：對照組MG63遷移細胞情況；B：hAMSC-CM細胞遷移情況( ×100)；C：不同組遷移細胞數(shù)比較，與CON組比較，*：P<0.05圖3 hAMSC-CM對MG63遷移能力的影響Fig.3 Effect of hAMSC-CM on MG63 cell migration

與CON組比較，*：P<0.05圖4 hAMSCs-CM對MG63中ALP活性的影響Fig.4 Effect of hAMSC-CM on ALP activity in MG63

3 討 論

MSCs廣泛存在于全身多種組織中，最早是由骨髓中提取出來[9]。然而骨髓間充質(zhì)干細胞來源有限，且提取方法具有侵入性，而羊膜取材方便，無倫理限制，且hAMSCs增殖及成骨分化能力比BMSCs更強[6-7,10]。本研究及既往研究均表明，hAMSCs不表達免疫因子HLA-DR、CD14，也不表達協(xié)同刺激分子CD80、CD83、CD86、CD40L等，具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用[11-12]，可以作為間充質(zhì)干細胞臨床應(yīng)用的理想細胞來源。

近年來人們研究證實，在骨組織工程中植入的MSCs主要通過旁分泌作用促進骨組織修復(fù)再生，且MSC-CM與MSCs具有相似的骨誘導(dǎo)作用[13-14]，這為MSC-CM在臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。研究表明，MSCs可通過分泌血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子beta、血管內(nèi)皮生長因子等可溶性生長因子，或通過胞外囊泡攜帶并傳遞遺傳信息等多種可能的途徑改變組織細胞所處的微環(huán)境，發(fā)揮旁分泌作用[15-17]。

本研究通過提取hAMSC-CM作用于人成骨樣細胞系MG63，檢測其對成骨細胞增殖、遷移及分化功能的影響。本研究證實hAMSC-CM對成骨細胞增殖和遷移具有顯著促進作用，ALP是成骨細胞分化早期的標志物，本研究通過pNPP法檢測hAMSC-CM培養(yǎng)5 d后成骨細胞內(nèi)ALP活性，在蛋白水平上驗證了hAMSC-CM對成骨細胞分化的顯著促進作用。由此提示hAMSCs可通過旁分泌作用增強成骨細胞生物活性，但具體作用的生長因子及其相關(guān)機制尚需進一步研究。

目前對于hAMSCs的研究主要把它作為骨組織工程的種子細胞，研究其自身成骨分化或?qū)撬栝g充質(zhì)干細胞成骨分化的影響[18-19]。有研究提示hAMSCs與成骨細胞共培養(yǎng)后，可促進成骨細胞分化指標表達，但文中并未明確標明實驗所用成骨細胞系的種類，且僅涉及hAMSCs對成骨細胞分化功能的影響[20]，同時培養(yǎng)兩種細胞的實驗操作難度大。有體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)植入的MSCs在體內(nèi)存活時間短、分化活性差[13-14]，且MSCs在儲存、培養(yǎng)和應(yīng)用操作中相對復(fù)雜，而MSC-CM可更方便臨床應(yīng)用，且不用擔(dān)心體內(nèi)成瘤的風(fēng)險[21]，所以在組織修復(fù)的體內(nèi)應(yīng)用中，MSC-CM有其獨特的優(yōu)勢。

綜上所述，本研究通過提取并鑒定hAMSCs，收取hAMSC-CM作用于成骨細胞，可顯著增強成骨細胞生物活性，為hAMSCs在骨組織修復(fù)領(lǐng)域的進一步研究提供了理論基礎(chǔ)。