凌曉旭，王家鳳，沙 青，程博群，張志民

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種高發(fā)病率、嚴重危害人類健康的代謝性疾病[1]。糖尿病的慢性高血糖癥會造成多種器官的損傷，發(fā)生多種并發(fā)癥如心血管疾病、慢性腎病、糖尿病眼病和糖尿病足等[2]。糖尿病患者口腔問題的發(fā)生率也很高，如齲齒、口干、牙周病、唾液腺功能障礙和口腔感染[3]。牙髓是一種疏松結締組織，在組織穩(wěn)態(tài)、損傷和衰老過程中，牙髓的活力取決于牙髓細胞的活性。牙髓細胞活性的降低可導致炎癥在內的多種病理狀態(tài)產生[4]。糖尿病患者的牙髓可能病變近年來引起口腔學者的重視。糖尿病可能是牙髓感染的調節(jié)因素。由糖尿病引起的血管病變可能干擾組織營養(yǎng)和牙髓修復，并可能為厭氧微生物的發(fā)育創(chuàng)造微需氧狀態(tài)[5]。糖尿病影響牙髓的愈合能力，病理性鈣化增加[6]。

氧化應激為糖尿病并發(fā)癥的一個重要致病因素，是高糖誘導細胞凋亡的主要因素。已有研究高糖對牙周膜干細胞、心肌細胞、足細胞、骨髓間充質細胞等氧化應激的影響。高糖是否誘導牙髓細胞的氧化應激，目前還缺乏相關資料。因此，為闡明高糖環(huán)境下牙髓活力改變的相關機制，本研究主要研究了不同濃度葡萄糖對人牙髓細胞(human dental pulp cells，HDPCs)增殖和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HDMEM培養(yǎng)基、PBS、青/鏈霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美國)；胎牛血清(FBS)(BI，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；線粒體膜電位試劑盒(JC-1)、CCK-8(碧云天公司，中國)；Anti-Cytokeratin8、Anti-Vimentin、HRP標記兔抗鼠二抗(萬類生物公司，中國)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(南京建成公司，中國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國)；流式細胞儀(BD AccuriTMC6，美國)。

1.2 人牙髓細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

收集吉林大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25歲健康、完整無齲的第三磨牙，均經患者(或家屬)知情同意。將拔出的牙齒在無菌條件下取出牙髓消化離心后移至培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2細胞孵箱培養(yǎng)，3 d換液1次，爬出細胞密度達80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。取處于對數期生長穩(wěn)定的牙髓細胞，制備細胞懸液，以5×103個/孔接種于24孔板中，行細胞波形蛋白及角蛋白免疫細胞化學染色，于倒置顯微鏡下觀察。

1.3 實驗分組

含葡萄糖濃度為25 mmol/L為正常組，葡萄糖5.5 mmol/L的培養(yǎng)液設為低糖組，50 mmol/L為高糖組，與50 mmol/L組滲透壓相等并與5.5 mmol/L組葡萄糖濃度相等為高滲組，每組設4個復孔。實驗重復3次。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將生長對數期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板，不同葡萄糖濃度分別培養(yǎng)1、3、5 d，每天同一時間，每孔加入100 μL不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，再加10 μL CCK-8，混勻后避光置于37 ℃CO2孵育箱培養(yǎng)1 h，以空白孔為調零孔，酶標儀測定在450 nm處吸光度值。

1.5 不同濃度葡萄糖對牙髓細胞氧化應激的影響

1.5.1 不同濃度葡萄糖對ROS的影響 ①熒光顯微鏡檢測細胞內ROS含量：將細胞以1×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，分組培養(yǎng)，達到干預時間72 h后，棄原培養(yǎng)基，加入含終濃度為10 μmol/L的熒光染料DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基在37 ℃條件下避光孵育30 min，預溫PBS洗3次，清洗結束后，孔板內可剩余少量PBS，熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。 ②熒光酶標儀檢測細胞內ROS含量：將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，72 h后加入DCFH-DA熒光酶標儀分析，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.5.2 不同濃度葡萄糖對MDA、SOD的影響 將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，不同條件處理后72 h，PBS清洗兩遍后棄盡液體，加入0.1%細胞裂解液400 μL，采用MDA、SOD試劑盒測定細胞中MDA、SOD的含量。

1.6 線粒體膜電位檢測

采用JC-1熒光探針在細胞內的紅/綠熒光強度比例來衡量線粒體去極化程度。細胞于培養(yǎng)瓶內不同條件培養(yǎng)72 h后，制備細胞懸液，加入JC-1在37 ℃孵育30 min，流式細胞術檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)的變化情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 牙髓細胞分離、培養(yǎng)及鑒定

利用組織塊酶消化法獲得的人牙髓組織順利貼壁，培養(yǎng)3～5 d后，顯微鏡下觀察可見組織塊周圍有細胞游出，細胞呈長梭形。約20 d左右細胞密度達80%時，用胰酶進行消化按1∶2傳代培養(yǎng)，細胞呈放射狀或旋渦狀排列。體外培養(yǎng)的HDPCs抗波形蛋白染色陽性，胞質內可見棕黃色顆粒附著，抗角蛋白染色陰性，胞質內未見棕黃色顆粒，胞質呈粉色，胞核呈藍色(圖1)。

2.2 不同濃度葡萄糖對牙髓細胞增殖活性的影響

高糖對體外HDPCs增殖的影響結果如下：①不同濃度的葡萄糖刺激HDPCs 1 d及3 d，低糖組和高糖組的OD值呈時間依賴性增高，增殖的峰值均出現在25 mmol/L葡萄糖濃度的正常組(與低糖組及高糖組比較，P<0.05)。②不同葡萄糖刺激HDPCs 5 d，低糖組與高糖組均有所下降，峰值出現在正常組(與低糖組及高糖組比較，P<0.05)。③高滲透壓刺激HDPCs,細胞增殖較正常組下降。

1a：原代人牙髓細胞培養(yǎng)第6天形態(tài)( ×40)；1b：人牙髓細胞第三代形態(tài)( ×40)；1c：波形蛋白免疫細胞化學染色陽性( ×100)；1d：角蛋白免疫細胞化學染色陰性( ×100)圖1 人牙髓細胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of HDPCs

圖2 不同濃度的葡萄糖對HDPCs增殖的影響Fig.2 Proliferation effect of various concentrations of glucose on HDPCs

2.3 不同濃度葡萄糖對ROS的影響

熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現各實驗組均出現綠色熒光，但強度不同，在正常組及低糖組的熒光強度較弱，而高糖組的熒光強度明顯增強，如圖3。采用多功能酶標儀對96孔板進行ROS定量測定，結果表明：各實驗組熒光強度存在明顯差異，高糖組OD值明顯高于其他3組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖4。

2.4 不同濃度葡萄糖對MDA、SOD的影響

4組細胞中抗氧化應激物質的分析如下：MDA含量高糖組OD值(2.44±0.30)，明顯高于正常組(1.39±0.12)，而SOD正常組(43.51±0.33)明顯高于高糖組(23.52±0.38)，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明高糖環(huán)境中SOD的活力降低，抗氧化能力下降。高滲組中MDA(1.49±0.35)、SOD(34.65±0.53)均與高糖組存在明顯差異，說明高糖對于牙髓細胞的影響并非由滲透壓引起，而是因改變了細胞內代謝物質引起。見圖5。

3a：正常組；3b：低糖組；3c：高糖組；3d：高滲組圖3 不同濃度葡萄糖HDPCs細胞ROS水平( ×100)Fig.3 The level of ROS in HDPCs under different concentrations of glucose( ×100)

**：P<0.01，***：P<0.001圖4 不同濃度葡萄糖牙髓細胞ROS的含量 Fig.4 The content of ROS in HDPCs under different concentrations of glucose

*：P<0.05，***：P<0.001圖5 不同濃度葡萄糖牙髓細胞 MDA、SOD水平Fig.5 The levels of MDA and SOD in HDPCs under different concentrations of glucose

2.5 不同濃度葡萄糖對線粒體膜電位的影響

JC-1試劑檢測結果如圖6所示，右上象限(Q2) 表示JC-1在細胞線粒體基質內，以聚合物的形式存在，產生紅色熒光，說明細胞正常，MMP較高，右下象限(Q4) 表示 JC-1在細胞內以單體形式存在，不能聚集在線粒體中，發(fā)出綠色熒光，細胞處于凋亡早期，MMP較低。高糖組(16.5%) 與正常組(7.8%) 相比，綠色熒光明顯增強，表示JC-1單體形態(tài)增多，提示高糖處理后的細胞線粒體膜電位降低。

6a：正常組；6b：低糖組；6c：高糖組；6d：高滲組圖6 不同濃度葡萄糖對HDPCs細胞線粒體膜電位的影響Fig.6 Effects of different glucose concentrations on mitochondrial membrane potential in HDPCs

3 討 論

口腔健康與糖尿病的關系已在文獻中被廣泛報道。在牙髓根尖周病方面，高糖水平增加大鼠牙髓組織骨橋蛋白的產生和病理鈣化[6]。高血糖刺激骨吸收，抑制成骨細胞分化，骨修復能力降低[7]，根尖周病變的發(fā)生率提高。有研究發(fā)現暴露于DM患者口腔菌斑的牙髓干細胞的克隆數量明顯減少[8]。一篇最近的綜述納入了10項研究以探討DM對牙髓及根尖周病變演變的影響，分析表明DM作為牙髓病理進展的危險因素，影響疾病的易感性、流行、發(fā)展和組織愈合能力[9]。而對高糖環(huán)境中牙髓細胞變化的研究較少，因此研究高濃度葡萄糖對牙髓細胞的影響對探明糖尿病患者牙髓組織結構變化及其作用機制具有重要意義。

越來越多的證據表明，高濃度葡萄糖會對不同的器官、組織和細胞類型產生不同的影響。高糖環(huán)境可能通過下調cyclin D1和上調p21抑制牙周膜細胞的增殖和細胞周期進程[10]。另有研究表明，與其他類型的細胞相比，成纖維細胞更能抵抗高葡萄糖水平，只有當葡萄糖濃度達到33.3 mmol/L以上時，細胞凋亡才會顯著增加[11]。本實驗采用高濃度葡萄糖干預體外培養(yǎng)的牙髓細胞以模擬體內高糖環(huán)境，發(fā)現25 mmol/L葡萄糖作用于牙髓細胞1、3、5 d后，牙髓細胞形態(tài)良好，細胞增殖活性最強，提示25 mmol/L是細胞生長的最適濃度。因此，將該葡萄糖濃度作為正常培養(yǎng)葡萄糖濃度組。我們選擇了體外濃度為50 mmol/L作為高糖組，這個劑量也得到了實驗中毒性試驗的支持，但是在該實驗中25 mmol/L高糖也明顯抑制HDPCs增殖[12]，我們的實驗中發(fā)現25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)牙髓細胞1、3 d后，細胞增殖活性強，高濃度50 mmol/L葡萄糖作用后，細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，5 d后各實驗組牙髓細胞的增殖受到抑制，細胞整體活性均較低，原因可能是隨著細胞增多，生長空間不足以及有害代謝產物的累積等。

牙髓作為牙本質-牙髓復合體的一部分，是一種高度血管化的組織，長期的血糖水平失衡導致牙本質AGE(糖基化終產物)的積累[13]。RAGE(AGE受體)分配在牙髓細胞表面，可能導致ROS水平劑量依賴性的增加[14]，高濃度的ROS激活免疫反應，細胞因子的產生增加，導致炎癥細胞反應[15]。糖尿病時，牙髓內ROS代謝增強，氧化應激增強[16]。本研究結果與其一致。氧化應激為糖尿病并發(fā)癥的一個重要致病因素。MDA是ROS與多不飽和脂肪酸反應的產物，檢測細胞內脂質過氧化程度以反映氧化應激水平。而SOD是一種重要的、普遍存在的酶，具有中和超氧自由基的重要作用，是體現細胞內還原力水平的指標。本研究檢測了不同濃度葡萄糖干預后牙髓細胞中ROS水平、MDA及SOD活力。結果顯示，高糖組細胞內ROS和MDA含量均增加，而SOD活力降低，提示高濃度葡萄糖促進ROS生成，使MDA含量增高，降低牙髓細胞中抗氧化酶SOD的活力，從而誘導牙髓細胞發(fā)生氧化應激反應，進而導致牙髓細胞損傷，這可能是高糖微環(huán)境引發(fā)牙髓病變的機制之一。Leite[17]的研究結果顯示糖尿病改變了牙髓的抗氧化系統(tǒng)，而動物實驗中，糖尿病大鼠牙髓組織SOD活性降低[18]。

線粒體作為細胞的能量代謝中心，在維持細胞的功能和代謝方面發(fā)揮了重要作用，線粒體功能障礙則可能導致細胞損傷。氧化應激被認為是糖尿病及其相關并發(fā)癥發(fā)病和進展的一個因素，線粒體和細胞核是氧化應激的兩個主要靶點。線粒體是ROS的主要來源，特別是受損傷的線粒體可以釋放出大量ROS，同時線粒體也容易受到ROS攻擊而損傷，高水平的線粒體ROS損害線粒體膜，并與線粒體膜滲透性增加有關，后者導致ROS向細胞質中滲漏，并損害其他細胞器[19]。線粒體膜電位的變化能反映氧化應激的水平[20]。最近，Rizwan等[21]的實驗研究了高糖環(huán)境對皮膚角化細胞影響，隨葡萄糖水平升高，細胞中ROS不斷積累，通過應激信號通路觸發(fā)細胞線粒體功能障礙、炎癥反應和細胞凋亡。而高糖環(huán)境誘導的HDPCs氧化應激、線粒體損傷及機制有待深入研究，本實驗檢測葡萄糖水平升高后牙髓細胞MMP降低，說明細胞處于凋亡早期，高糖可誘導牙髓細胞的凋亡，為后續(xù)實驗奠定基礎。

綜上所述，高糖濃度抑制牙髓細胞的增殖，導致HDPCs線粒體膜電位下降，誘導氧化應激產生，高血糖環(huán)境降低了牙髓細胞的活力，也可能是糖尿病患者牙髓組織發(fā)生改變的一個潛在因素。本實驗仍存在不足，未探討高糖對牙髓病狀態(tài)下牙髓細胞的影響，進一步解釋糖尿病與牙髓病的關系。關于高糖誘導牙髓細胞凋亡的深層次機制、高糖誘導的氧化應激介導線粒體功能障礙和應激信號級聯反應的改變、信號通路等，尚需要進一步研究。