李剛榮 白明明 陶朝欣 楊會濤 許麗亞

(1.河北省強制隔離戒毒所醫(yī)院檢驗科，石家莊 050081；2.石家莊榮璦醫(yī)學(xué)檢驗所檢驗科，石家莊 050021)

近年來，隨著人口老齡化及抗生素的廣泛使用，肺部真菌感染呈升高趨勢，當(dāng)機體免疫功能低下時可引發(fā)肺部真菌感染[1]，真菌感染后的早期診斷及時治療對降低患者死亡率至關(guān)重要。真菌的檢測手段一直以來是臨床最為迫切的需求，血漿(1,3)-β-D葡聚糖(BG)試驗(G試驗，Glucan test)和半乳甘露聚糖抗原檢測試驗(GM試驗,Galactomannan test)的發(fā)展和推廣，為臨床提供了快速有效的檢測方法。支氣管肺泡灌洗液(brondioalveolar lavage fluid，BALF)的G/GM試驗在用于肺部真菌感染的診斷方面逐年推廣，相較于傳統(tǒng)的檢測方法，該方法具有快速高效、靈敏度和特異性較高的優(yōu)勢，因而被廣泛運用于臨床[2]。

真菌免疫熒光染色檢測是近年來新發(fā)展的一種染色技術(shù)，染色液中的熒光增白劑是一種熒光染料，與多種植物以及真菌細胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素具有較強的親和力，在特定的紫外光下(350～400 nm)，能夠發(fā)出亮藍色熒光，通過熒光顯微鏡觀察其形態(tài)，可達到檢測出真菌的目的。我們對142例BALF進行G試驗和GM試驗檢測，同時進行免疫熒光染色法和氫氧化鉀(KOH)濕片法鏡檢作對比，以期為肺部真菌感染提供更便捷高效的早期聯(lián)合檢測方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2019年1月至12月送檢至本所的BALF真菌檢測G試驗/GM試驗142例，其中男性94例，女性48例，年齡14～86歲，中位年齡55.5歲，臨床初步診斷分別為慢性阻塞性肺部疾病(COPD)59例，重癥肺炎21例，真菌性肺炎24例，肺部感染待查38例。所有送檢的BALF在G/GM試驗的同時進行免疫熒光染色檢測和KOH濕片法鏡檢，并根據(jù)檢測結(jié)果進行分析。

1.2 標(biāo)本采集

所有BALF均為支氣管鏡下采集，方法如下：患者無纖支鏡禁忌證，應(yīng)用2%利多卡因為患者進行局部麻醉，待麻醉生效后，經(jīng)鼻腔置入纖支鏡，向可疑肺病變部位進行灌洗，灌洗液為滅菌氯化鈉注射液，每次30～50 mL，連續(xù)灌洗3～4次后，采用負壓吸引下對灌洗液進行回收，收集灌洗液10～15 mL進行送檢。

1.3 檢測試劑

真菌免疫熒光顯色試劑II型購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，10%KOH溶液為本室自制。顯微鏡采用奧林巴斯CX31光學(xué)顯微鏡和熒光模塊(MF-UV-LED-0-3型)。G試驗試劑盒為真菌葡聚糖檢測試劑盒(動態(tài)濁度法)，購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，Platelia TM曲霉菌抗原檢測試劑盒購自美國伯樂公司。所有實驗步驟均按本室SOP操作。

1.4 檢驗方法

BALFG試驗和GM試驗 低溫保存并無菌送檢的BALF經(jīng)離心處理后，采集上清液進行G、GM試驗。BALF G試驗采用動態(tài)濁度法，應(yīng)用TALgent動態(tài)檢測系統(tǒng)，檢測結(jié)果以其濃度值大于20 pg/mL作為陽性判定標(biāo)準。GM試驗運用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心一步法，對每個受檢標(biāo)本計算指數(shù)I，BALF的GM試驗以待測標(biāo)本的指數(shù)I≥0.5作為陽性判定標(biāo)準。

真菌免疫熒光染色 按試劑盒操作說明書進行，取待測BALF標(biāo)本離心2000 g/10 min，棄上清液并充分混合沉淀物，以無菌吸管吸取標(biāo)本，取一滴均勻涂至潔凈載玻片上，分別滴加熒光染色液A液和B液各1滴，覆上蓋玻片，靜置1 min后鏡檢。結(jié)果判讀：真菌的菌絲及孢子均呈亮藍色，結(jié)構(gòu)清晰明顯，其他細菌和組織呈弱藍色熒光，背景為藍黑色，陽性報告為標(biāo)本經(jīng)熒光染色可見有隔的真菌菌絲和卵圓形真菌孢子，陰性報告為未找到真菌菌絲和孢子。

KOH濕片直接鏡檢 標(biāo)本同免疫熒光染色處理后滴加1滴10%KOH溶液，蓋上蓋玻片，酒精燈火焰上微加熱后，輕壓蓋玻片，使標(biāo)本透明，顯微鏡下直接觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0分析軟件進行處理，所得計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準差表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗的方法，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BALF真菌直接鏡檢兩種方法檢測結(jié)果比較

142例BALF標(biāo)本中免疫熒光染色檢測陽性52例，陰性90例，陽性率為36.62%；KOH濕片直接鏡檢檢測陽性27例，陰性115例，陽性率19.01%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=45.003，P<0.001)，見表1。

表1 BALF真菌免疫熒光染色檢測與KOH濕片法直接鏡檢檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison between the results of fluorescent staining of BALF fungi and the results of direct microscopic examination by KOH

2.2 BALF G/GM試驗檢測結(jié)果

以BG濃度高于20 pg/mL作為陽性，G試驗檢測出陽性例數(shù)為89例(占62.68%)。同時以單次I值大于0.5為陽性，GM試驗陽性例數(shù)為23例(占16.20%)，見表2。

表2 142例BALF G試驗與GM試驗檢測結(jié)果Tab.2 Results of BALF G test and GM test in 142 cases

2.3 BALF G試驗與免疫熒光染色聯(lián)合檢測結(jié)果

根據(jù)真菌免疫熒光染色操作說明書，檢出真菌菌絲或孢子者判斷為真菌免疫熒光染色檢測結(jié)果為陽性，52例BALF 真菌免疫熒光染色檢測陽性中同時G試驗陽性者為49例，GM試驗陽性者為11例，見表3。G試驗陽性中免疫熒光染色陽性時BALF G試驗(BG)濃度與陰性時BG濃度比較，兩者差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.814)，見表4。

表3 142例BALF G/GM試驗與免疫熒光染色檢測結(jié)果Tab.3 Results of BALF G / GM test and immunofluorescent staining in 142 cases

表4 真菌免疫熒光染色陽性BG濃度結(jié)果比較 [例(%)]Tab.4 Comparison of G-test results of fungus fluorescent staining positive BALF [n(%)]

3 討 論

肺部真菌感染的早期診斷對臨床上很多免疫功能低下的老年患者來說是關(guān)鍵因素，而傳統(tǒng)的呼吸道痰培養(yǎng)及KOH濕片法鏡檢檢出真菌方法敏感性及特異性均較差。G試驗是一種通過顯色法對產(chǎn)生(1,3)-β-D葡聚糖的真菌感染進行早期診斷的方法，因普遍存在于真菌細胞壁中，能特異性激活鱟成份中的凝血因子G因子從而激活鱟試驗[3]。體液中的BG含量上升是人體感染真菌后的1種現(xiàn)象，檢測其水平已成為肺部真菌感染診斷的重要手段。有研究表明BALF(1,3)-β-D葡聚糖濃度峰值出現(xiàn)時間要早于血漿，且具有較高的特異性，有利于早期診斷[4]。GM試驗是檢測大多數(shù)曲霉感染的一種手段，曲霉在體內(nèi)外生長時都能釋放GM抗原。研究表明支氣管鏡下采集BALF行GM試驗聯(lián)合G試驗，對于診斷肺曲霉病優(yōu)于單獨的GM試驗、G試驗以及血清GM試驗聯(lián)合G試驗，而聯(lián)合檢測可以彌補單項檢測的不足，具有準確率高、靈敏度高和特異度高等優(yōu)點，有助于肺曲霉的早期診斷[5]。

免疫熒光染色檢測真菌可直接通過熒光顯微鏡觀察真菌形態(tài)，鏡下菌絲和孢子結(jié)構(gòu)清晰可見(見圖1～8)，顯微鏡下直接檢測出菌絲或者孢子對臨床深部真菌感染具有直接指導(dǎo)作用。無論淺部真菌還是深部真菌，相較傳統(tǒng)的KOH濕片法大大提高了真菌的檢出率[6]，同時免疫熒光染色后標(biāo)本中的菌絲孢子呈現(xiàn)亮藍色，易分辨，不易漏檢和誤檢，分析顯示免疫熒光染色的真菌檢出率明顯高于KOH濕片法(見表1)。

通過對BALF真菌免疫熒光染色檢測結(jié)果與G/GM試驗的對比分析發(fā)現(xiàn)，142例BALF檢測G試驗陽性共89例，免疫熒光染色陽性為52例，免疫熒光染色與G實驗同時陽性者為49例，與GM試驗同時陽性者為11例。BALF中G/GM試驗的聯(lián)合檢測對于肺部真菌感染的指導(dǎo)價值，已有很多臨床研究進行了探討。BALF真菌免疫熒光染色檢測受到真菌在標(biāo)本中的含量及檢驗醫(yī)師的閱片水平等因素的影響，存在一定程度的假陰性率，在試驗設(shè)定的G試驗和GM試驗陽性標(biāo)準下，真菌免疫熒光染色檢測的相對假陰性率分別為44.94%和52.17%。BALF G試驗陽性時真菌免疫熒光染色陽性與陰性的BG濃度值之間并無顯著差異，P=0.814(見表4)，表明在顯微鏡下未檢測出真菌時，通過G試驗仍可能檢測出高濃度BG，可能與真菌感染局部肺組織后形態(tài)被破壞或者標(biāo)本采集的因素影響有關(guān)，這也是導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的原因。同時仍有3例(5.67%)G試驗陰性BALF標(biāo)本中通過免疫熒光染色直接檢測出真菌(見表3)，因此，采用多種方法聯(lián)合檢測共同分析肺部真菌感染，避免單一檢測方法的假陽性或假陰性是臨床診斷工作中的重要方法。

圖1-4 BALF真菌免疫熒光染色檢測鏡下菌絲(10×40) 圖5-8 BALF真菌免疫熒光染色檢測鏡下孢子(10×40)Fig.1-4 Detection of hyphae (10×40) in BALF by immunofluorescent staining Fig.5-8 Detection of spores (10×40) in BALF by immunofluorescent staining

真菌菌絲及孢子經(jīng)熒光染色后，形態(tài)清晰，輪廓分明，易于識別，能提高常規(guī)染色和KOH濕片檢測真菌的陽性率，對于一些特殊的典型菌體如曲霉、馬爾尼菲籃狀菌、毛霉、接合菌還可以提供初步的形態(tài)學(xué)診斷[7]，這是其他快速檢測方法所不具備的。因此真菌免疫熒光染色檢測作為一種快速方便高效直觀的真菌常規(guī)檢測方法，是BALF標(biāo)本真菌檢測的重要補充，為臨床肺部真菌感染的診斷提供了一種快速檢測方法。進一步將真菌免疫熒光染色檢測技術(shù)聯(lián)合其他檢測方法，降低肺部及其他臟器的真菌感染假陰性率是今后的重點研究課題。