張 婷 郭穎昕 陳偉燕 石海芹 郭燕燕

上海上藥中西制藥有限公司 （上海 201806）

枸櫞酸托法替布又名枸櫞酸托法替尼，即（3R,4R）-4-甲基-3-（甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基）-β-氧代-1-哌啶丙腈枸櫞酸鹽（C16H20N6O·C6H8O7），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 枸櫞酸托法替布的化學(xué)結(jié)構(gòu)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種由關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、抗瓜氨酸肽抗體和類風(fēng)濕因子的異常表達(dá)介導(dǎo)的慢性系統(tǒng)免疫性疾病，其臨床癥狀主要為滑膜增生、血管翳的形成、軟骨損失和關(guān)節(jié)破壞等，如不及時(shí)給予規(guī)范治療，病情可逐漸加重，最后導(dǎo)致畸形、關(guān)節(jié)強(qiáng)直和功能喪失，是臨床常見的主要致殘性疾病之一。我國(guó)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患病人數(shù)近500 萬(wàn)；該病致殘率高，給社會(huì)和患者均造成沉重的負(fù)擔(dān)。

目前，針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療有很多種，主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類藥物、慢作用抗風(fēng)濕藥、生物藥物及小分子激酶（JAK）抑制劑。JAK 屬于胞內(nèi)酪氨酸激酶家族，能夠從細(xì)胞因子、干擾素和多種激素受體向細(xì)胞核傳遞信號(hào)，從而合成多種生物活性物質(zhì)，影響細(xì)胞的代謝和功能，因此，激酶功能障礙則會(huì)導(dǎo)致造血功能障礙和免疫功能低下。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的治療過程中，選用JAK抑制劑可以迅速有效地抑制炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)，從而達(dá)到治療目的[1]。

枸櫞酸托法替布是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于人類自身免疫性疾病的小分子非受體型酪氨酸蛋白激酶抑制劑。枸櫞酸托法替布片于2012 年在美國(guó)首先批準(zhǔn)上市，目前已在日本、俄羅斯、澳大利亞、加拿大等全球50 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)獲得上市批準(zhǔn)。2017 年，歐洲藥品管理局（EMA）也批準(zhǔn)該藥用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，并對(duì)近5 000 名患者進(jìn)行隨訪，其長(zhǎng)期安全性和有效性數(shù)據(jù)得到了進(jìn)一步證實(shí)。枸櫞酸托法替布的臨床療效顯著，且可與甲氨蝶呤或其他非生物改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARD）聯(lián)合使用，不良反應(yīng)輕微、安全性高、服用方便，深受醫(yī)生和患者的青睞[2-3]，是近年世界范圍內(nèi)銷售量增長(zhǎng)較快的藥物之一。

枸櫞酸托法替布為化學(xué)藥物3 類藥。目前，對(duì)于枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定還不夠全面。根據(jù)其合成工藝及降解機(jī)制，選取了9 種主要的已知雜質(zhì) ，包括工藝雜質(zhì) TZ1、TZ3、TZ4、TZ5、PF-05211077、PF-05287430 以及降解雜質(zhì)TZ2、PF-05579970、P-05091895。為了進(jìn)一步控制上海上藥中西制藥有限公司產(chǎn)品枸櫞酸托法替布片的質(zhì)量，參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[1-7]，系統(tǒng)地研究分析了枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)9 種已知雜質(zhì)的測(cè)定，并采用C18色譜柱、利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）建立了枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。依據(jù)外標(biāo)法測(cè)定4 種已知雜質(zhì)的含量，采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定另外5 種已知雜質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該方法具有良好的專屬性、耐用性、穩(wěn)定性，以及較高的靈敏度[4-5]，也進(jìn)一步說明其適用于上海上藥中西制藥有限公司產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

AL104 電子天平、XPE105 電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；1260 全自動(dòng)高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試劑

三氟乙酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈，默克股份兩合公司；癸烷磺酸鈉，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。所用試劑均為色譜純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)過程中所使用的標(biāo)準(zhǔn)品信息如表1 所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑［CAPCELL PAK C18MG（4.6 mm×150 mm，3 μm）或效能相當(dāng)?shù)纳V柱］，加裝捕集柱（Ghost-Buster，4.6×50 mm）；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，加入1 mL 0.5 mg/mL 的癸烷磺酸鈉溶液，混勻）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫。梯度程序如表2 所示。洗脫流速為0.8 mL/min，柱溫箱溫度為45 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm。

表2 梯度洗脫比例

1.4.2 溶液的配制

（1）系統(tǒng)適用性溶液的制備

取枸櫞酸托法替布對(duì)照品及各雜質(zhì)對(duì)照品適量，配制成每1 mL 中含托法替布0.15 mg，TZ1、TZ2、TZ3、TZ4、TZ5 各0.8 μg，PF-05579970、PF-05091895、PF-05287430、PF-05211077 各0.375 μg的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

（2）供試品溶液的制備

稱取本品研磨細(xì)粉適量（約相當(dāng)于托法替布15 mg），置于100 mL 容量瓶中；加乙腈-0.05%三氟乙酸（二者體積比為5∶95，下同）溶液振搖使托法替布溶解，放冷；加乙腈-0.05%三氟乙酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

（3）對(duì)照溶液的制備

精密量取供試品溶液適量，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋，制成每1 mL 中含0.75 μg 托法替布的溶液作為對(duì)照溶液。

（4）靈敏度溶液的制備

精密量取供試品溶液適量，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋，制成每1 mL 中含0.03 μg 托法替布的溶液作為靈敏度溶液。

（5）混合對(duì)照品溶液的制備

取雜質(zhì)TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077對(duì)照品適量，精密稱定，用乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋，制成每1 mL中含雜質(zhì)TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077 各0.3 μg 的混合溶液作為混合對(duì)照品溶液。

1.4.3 測(cè)定方法

分別取系統(tǒng)適用性溶液及靈敏度溶液各20 μL注入液相色譜儀，考察分離度并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度使主峰峰高的信噪比大于10；分別取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3 倍。采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品雜質(zhì)TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077 的含量，采用自身對(duì)照法計(jì)算供試品雜質(zhì)PF-05579970、PF-05287430 、TZ1、TZ2、TZ5 的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果如表3 所示。在有關(guān)物質(zhì)色譜條件下，理論板數(shù)按托法替布計(jì)為20 323，各峰間的分離度均大于2.1，說明該法色譜條件分離效果良好。

2.2 檢測(cè)限（LOD）、定量限（LOQ）試驗(yàn)

精密稱取枸櫞酸托法替布標(biāo)準(zhǔn)品及各雜質(zhì)適量，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液逐級(jí)稀釋，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度以主成分峰的峰高與基線噪音的信噪比大于或等于10 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限；將定量限質(zhì)量濃度繼續(xù)稀釋，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，以主成分峰峰高與基線噪音的信噪比大于或等于3 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。由表4 結(jié)果可見，在該色譜條件下，各雜質(zhì)檢測(cè)限均在供試品質(zhì)量濃度1‰之下，說明該色譜法靈敏度較高。

表3 有關(guān)物質(zhì)-系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

表4 有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限與定量限ng/mL

2.3 專屬性考察

稱取空白輔料約600 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入乙腈-0.05%三氟乙酸溶液適量，超聲處理至分散均勻，放冷，定容、搖勻、濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液；稱取空白包衣材料約18 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入乙腈-0.05%三氟乙酸溶液適量，超聲處理至分散均勻，放冷，定容、搖勻、濾過，取續(xù)濾液作為空白包衣溶液；分別精密量取20 μL空白輔料溶液、空白包衣溶液注入液相色譜儀，結(jié)果表明輔料及包衣材料均不干擾樣品的檢測(cè)。

2.4 線性試驗(yàn)

精密稱取枸櫞酸托法替布及各雜質(zhì)對(duì)照品適量，分別用乙腈-0.05%三氟乙酸溶液稀釋制成一系列不同質(zhì)量濃度溶液，在有關(guān)物質(zhì)色譜條件下，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按上述同法進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如表5 所示。

表5 枸櫞酸托法替布及各雜質(zhì)線性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)結(jié)果，TZ2 在0.039 8～1.593 5 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.027%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；PF-05579970 在0.037 3～1.491 6 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.025%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；TZ3 在0.039 8～1.590 4 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.027%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；PF-05091895 在0.054 7～1.457 5 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.036%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；托法替布在0.029 6～1.480 1 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.020%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；TZ1 在0.039 4～1.575 1 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.027%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；TZ4 在0.081 7～1.633 1 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.054%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；PF-05287430 在0.018 7～1.494 9 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.012%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；TZ5 在0.039 1～1.565 6 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.026%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；PF-05211077 在0.037 0～1.481 5 μg/mL（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.025%～1.000%）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品內(nèi)容物適量，按有關(guān)物質(zhì)測(cè)定法制備供試品溶液，在室溫（不避光）下放置48 h 后，精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，供試品溶液室溫下放置48 h 內(nèi)，各雜質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）與0 h 含量的絕對(duì)差值為0～0.02%，總雜含量的絕對(duì)差值為0.02%。因此，供試品溶液在室溫下48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品適量，按上述方法制備供試品溶液及對(duì)照品溶液。同法操作6 份，按上述方法檢查有關(guān)物質(zhì)，計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。6 份供試品溶液中：TZ2含量的均值為0.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0；平均相對(duì)保留時(shí)間（RRT）為0.68 的雜質(zhì)含量的均值為0.01%，RSD 為0；RRT 為0.77 的雜質(zhì)含量的均值為0.01%，RSD 為0；RRT 為1.69 的雜質(zhì)含量的均值為0.02%，RSD 為0.01%；RRT 為1.90 的雜質(zhì)含量的均值為0.02%，RSD 為0；RRT 為2.13 的雜質(zhì)含量的均值為0.02%，RSD 為0；PF-05091895 含量的均值為0.03%。6 份供試品溶液的絕對(duì)差值為0.01%，總雜含量的RSD 為4.23%，表明該測(cè)定方法具有優(yōu)異的重復(fù)性。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別精密稱取各雜質(zhì)10 mg 置于1 000 mL 容量瓶中，各加乙腈－0.05%三氟乙酸溶液溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，作為各個(gè)雜質(zhì)儲(chǔ)備液。按處方量分別加入枸櫞酸托法替布及空白輔料；每種雜質(zhì)分別設(shè)計(jì)3 個(gè)不同的質(zhì)量濃度，各制成每1 mL 分別含雜質(zhì)約0.1，0.4 和0.5 ng 的混合溶液。每個(gè)質(zhì)量濃度分別配制3 份供試品溶液，按上述方法進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果如表6 所示。采用該法測(cè)定的枸櫞酸托法替布各雜質(zhì)9 份樣品平均回收率均在97%～104%之間，RSD 均符合接受標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法準(zhǔn)確度高，也進(jìn)一步證實(shí)了該測(cè)定方法的精確性與可靠性良好。

表6 有關(guān)物質(zhì)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

按前文所述配制系統(tǒng)適用性溶液，按照相關(guān)測(cè)定方法，每次只改變一個(gè)色譜條件，考察該方法的耐用性，結(jié)果如表7 所示。

表7 有關(guān)物質(zhì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果

由表7 可知，進(jìn)樣流速、離子對(duì)試劑比例、色譜柱批號(hào)、柱溫箱溫度等在一定程度下均不影響主藥的測(cè)定，表明該方法的系統(tǒng)耐用性良好。

3 結(jié)語(yǔ)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑［CAPCELL PAK C18MG（4.6 mm×150 mm，3 μm）或效能相當(dāng)?shù)纳V柱］，以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，建立反相高效液相色譜法對(duì)枸櫞酸托法替布片有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，該法靈敏度高、雜質(zhì)分離效果好、耐用性優(yōu)異，溶液質(zhì)量濃度與峰面積相關(guān)性顯著，處方中輔料不干擾藥物含量的測(cè)定，且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、準(zhǔn)確度高，適用于枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。