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        反相高效液相色譜測(cè)定枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)研究

        2021-02-26 07:16:14郭穎昕陳偉燕石海芹郭燕燕

        張 婷 郭穎昕 陳偉燕 石海芹 郭燕燕

        上海上藥中西制藥有限公司 (上海 201806)

        枸櫞酸托法替布又名枸櫞酸托法替尼,即(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-β-氧代-1-哌啶丙腈枸櫞酸鹽(C16H20N6O·C6H8O7),其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

        圖1 枸櫞酸托法替布的化學(xué)結(jié)構(gòu)

        類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種由關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥、抗瓜氨酸肽抗體和類風(fēng)濕因子的異常表達(dá)介導(dǎo)的慢性系統(tǒng)免疫性疾病,其臨床癥狀主要為滑膜增生、血管翳的形成、軟骨損失和關(guān)節(jié)破壞等,如不及時(shí)給予規(guī)范治療,病情可逐漸加重,最后導(dǎo)致畸形、關(guān)節(jié)強(qiáng)直和功能喪失,是臨床常見的主要致殘性疾病之一。我國(guó)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患病人數(shù)近500 萬(wàn);該病致殘率高,給社會(huì)和患者均造成沉重的負(fù)擔(dān)。

        目前,針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療有很多種,主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類藥物、慢作用抗風(fēng)濕藥、生物藥物及小分子激酶(JAK)抑制劑。JAK 屬于胞內(nèi)酪氨酸激酶家族,能夠從細(xì)胞因子、干擾素和多種激素受體向細(xì)胞核傳遞信號(hào),從而合成多種生物活性物質(zhì),影響細(xì)胞的代謝和功能,因此,激酶功能障礙則會(huì)導(dǎo)致造血功能障礙和免疫功能低下。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的治療過程中,選用JAK抑制劑可以迅速有效地抑制炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá),從而達(dá)到治療目的[1]。

        枸櫞酸托法替布是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于人類自身免疫性疾病的小分子非受體型酪氨酸蛋白激酶抑制劑。枸櫞酸托法替布片于2012 年在美國(guó)首先批準(zhǔn)上市,目前已在日本、俄羅斯、澳大利亞、加拿大等全球50 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)獲得上市批準(zhǔn)。2017 年,歐洲藥品管理局(EMA)也批準(zhǔn)該藥用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療,并對(duì)近5 000 名患者進(jìn)行隨訪,其長(zhǎng)期安全性和有效性數(shù)據(jù)得到了進(jìn)一步證實(shí)。枸櫞酸托法替布的臨床療效顯著,且可與甲氨蝶呤或其他非生物改善病情抗風(fēng)濕藥(DMARD)聯(lián)合使用,不良反應(yīng)輕微、安全性高、服用方便,深受醫(yī)生和患者的青睞[2-3],是近年世界范圍內(nèi)銷售量增長(zhǎng)較快的藥物之一。

        枸櫞酸托法替布為化學(xué)藥物3 類藥。目前,對(duì)于枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定還不夠全面。根據(jù)其合成工藝及降解機(jī)制,選取了9 種主要的已知雜質(zhì) ,包括工藝雜質(zhì) TZ1、TZ3、TZ4、TZ5、PF-05211077、PF-05287430 以及降解雜質(zhì)TZ2、PF-05579970、P-05091895。為了進(jìn)一步控制上海上藥中西制藥有限公司產(chǎn)品枸櫞酸托法替布片的質(zhì)量,參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[1-7],系統(tǒng)地研究分析了枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)9 種已知雜質(zhì)的測(cè)定,并采用C18色譜柱、利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)建立了枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。依據(jù)外標(biāo)法測(cè)定4 種已知雜質(zhì)的含量,采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定另外5 種已知雜質(zhì)。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),該方法具有良好的專屬性、耐用性、穩(wěn)定性,以及較高的靈敏度[4-5],也進(jìn)一步說明其適用于上海上藥中西制藥有限公司產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)的檢測(cè)。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器

        AL104 電子天平、XPE105 電子天平,梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司;1260 全自動(dòng)高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

        1.2 試劑

        三氟乙酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈,默克股份兩合公司;癸烷磺酸鈉,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。所用試劑均為色譜純。

        1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

        實(shí)驗(yàn)過程中所使用的標(biāo)準(zhǔn)品信息如表1 所示。

        表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息

        1.4 方法

        1.4.1 色譜條件

        用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[CAPCELL PAK C18MG(4.6 mm×150 mm,3 μm)或效能相當(dāng)?shù)纳V柱],加裝捕集柱(Ghost-Buster,4.6×50 mm);以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀1.36 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,加入1 mL 0.5 mg/mL 的癸烷磺酸鈉溶液,混勻)為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,梯度洗脫。梯度程序如表2 所示。洗脫流速為0.8 mL/min,柱溫箱溫度為45 ℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm。

        表2 梯度洗脫比例

        1.4.2 溶液的配制

        (1)系統(tǒng)適用性溶液的制備

        取枸櫞酸托法替布對(duì)照品及各雜質(zhì)對(duì)照品適量,配制成每1 mL 中含托法替布0.15 mg,TZ1、TZ2、TZ3、TZ4、TZ5 各0.8 μg,PF-05579970、PF-05091895、PF-05287430、PF-05211077 各0.375 μg的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

        (2)供試品溶液的制備

        稱取本品研磨細(xì)粉適量(約相當(dāng)于托法替布15 mg),置于100 mL 容量瓶中;加乙腈-0.05%三氟乙酸(二者體積比為5∶95,下同)溶液振搖使托法替布溶解,放冷;加乙腈-0.05%三氟乙酸溶液稀釋至刻度,搖勻,濾過,作為供試品溶液。

        (3)對(duì)照溶液的制備

        精密量取供試品溶液適量,以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋,制成每1 mL 中含0.75 μg 托法替布的溶液作為對(duì)照溶液。

        (4)靈敏度溶液的制備

        精密量取供試品溶液適量,以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋,制成每1 mL 中含0.03 μg 托法替布的溶液作為靈敏度溶液。

        (5)混合對(duì)照品溶液的制備

        取雜質(zhì)TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077對(duì)照品適量,精密稱定,用乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋,制成每1 mL中含雜質(zhì)TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077 各0.3 μg 的混合溶液作為混合對(duì)照品溶液。

        1.4.3 測(cè)定方法

        分別取系統(tǒng)適用性溶液及靈敏度溶液各20 μL注入液相色譜儀,考察分離度并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度使主峰峰高的信噪比大于10;分別取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3 倍。采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品雜質(zhì)TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077 的含量,采用自身對(duì)照法計(jì)算供試品雜質(zhì)PF-05579970、PF-05287430 、TZ1、TZ2、TZ5 的含量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

        取系統(tǒng)適用性溶液20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果如表3 所示。在有關(guān)物質(zhì)色譜條件下,理論板數(shù)按托法替布計(jì)為20 323,各峰間的分離度均大于2.1,說明該法色譜條件分離效果良好。

        2.2 檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)試驗(yàn)

        精密稱取枸櫞酸托法替布標(biāo)準(zhǔn)品及各雜質(zhì)適量,以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液逐級(jí)稀釋,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度以主成分峰的峰高與基線噪音的信噪比大于或等于10 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限;將定量限質(zhì)量濃度繼續(xù)稀釋,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,以主成分峰峰高與基線噪音的信噪比大于或等于3 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。由表4 結(jié)果可見,在該色譜條件下,各雜質(zhì)檢測(cè)限均在供試品質(zhì)量濃度1‰之下,說明該色譜法靈敏度較高。

        表3 有關(guān)物質(zhì)-系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

        表4 有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限與定量限ng/mL

        2.3 專屬性考察

        稱取空白輔料約600 mg,置于100 mL 容量瓶中,加入乙腈-0.05%三氟乙酸溶液適量,超聲處理至分散均勻,放冷,定容、搖勻、濾過,取續(xù)濾液作為空白輔料溶液;稱取空白包衣材料約18 mg,置于100 mL 容量瓶中,加入乙腈-0.05%三氟乙酸溶液適量,超聲處理至分散均勻,放冷,定容、搖勻、濾過,取續(xù)濾液作為空白包衣溶液;分別精密量取20 μL空白輔料溶液、空白包衣溶液注入液相色譜儀,結(jié)果表明輔料及包衣材料均不干擾樣品的檢測(cè)。

        2.4 線性試驗(yàn)

        精密稱取枸櫞酸托法替布及各雜質(zhì)對(duì)照品適量,分別用乙腈-0.05%三氟乙酸溶液稀釋制成一系列不同質(zhì)量濃度溶液,在有關(guān)物質(zhì)色譜條件下,分別精密量取20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按上述同法進(jìn)行線性回歸,結(jié)果如表5 所示。

        表5 枸櫞酸托法替布及各雜質(zhì)線性試驗(yàn)結(jié)果

        根據(jù)結(jié)果,TZ2 在0.039 8~1.593 5 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.027%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;PF-05579970 在0.037 3~1.491 6 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.025%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;TZ3 在0.039 8~1.590 4 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.027%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;PF-05091895 在0.054 7~1.457 5 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.036%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;托法替布在0.029 6~1.480 1 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.020%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;TZ1 在0.039 4~1.575 1 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.027%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;TZ4 在0.081 7~1.633 1 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.054%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;PF-05287430 在0.018 7~1.494 9 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.012%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;TZ5 在0.039 1~1.565 6 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.026%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好;PF-05211077 在0.037 0~1.481 5 μg/mL(相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.025%~1.000%)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

        2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取本品內(nèi)容物適量,按有關(guān)物質(zhì)測(cè)定法制備供試品溶液,在室溫(不避光)下放置48 h 后,精密量取20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖,考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,供試品溶液室溫下放置48 h 內(nèi),各雜質(zhì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)與0 h 含量的絕對(duì)差值為0~0.02%,總雜含量的絕對(duì)差值為0.02%。因此,供試品溶液在室溫下48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

        取本品適量,按上述方法制備供試品溶液及對(duì)照品溶液。同法操作6 份,按上述方法檢查有關(guān)物質(zhì),計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。6 份供試品溶液中:TZ2含量的均值為0.04%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0;平均相對(duì)保留時(shí)間(RRT)為0.68 的雜質(zhì)含量的均值為0.01%,RSD 為0;RRT 為0.77 的雜質(zhì)含量的均值為0.01%,RSD 為0;RRT 為1.69 的雜質(zhì)含量的均值為0.02%,RSD 為0.01%;RRT 為1.90 的雜質(zhì)含量的均值為0.02%,RSD 為0;RRT 為2.13 的雜質(zhì)含量的均值為0.02%,RSD 為0;PF-05091895 含量的均值為0.03%。6 份供試品溶液的絕對(duì)差值為0.01%,總雜含量的RSD 為4.23%,表明該測(cè)定方法具有優(yōu)異的重復(fù)性。

        2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

        分別精密稱取各雜質(zhì)10 mg 置于1 000 mL 容量瓶中,各加乙腈-0.05%三氟乙酸溶液溶解并稀釋定容至刻度,搖勻,作為各個(gè)雜質(zhì)儲(chǔ)備液。按處方量分別加入枸櫞酸托法替布及空白輔料;每種雜質(zhì)分別設(shè)計(jì)3 個(gè)不同的質(zhì)量濃度,各制成每1 mL 分別含雜質(zhì)約0.1,0.4 和0.5 ng 的混合溶液。每個(gè)質(zhì)量濃度分別配制3 份供試品溶液,按上述方法進(jìn)行回收率測(cè)定,結(jié)果如表6 所示。采用該法測(cè)定的枸櫞酸托法替布各雜質(zhì)9 份樣品平均回收率均在97%~104%之間,RSD 均符合接受標(biāo)準(zhǔn),表明該方法準(zhǔn)確度高,也進(jìn)一步證實(shí)了該測(cè)定方法的精確性與可靠性良好。

        表6 有關(guān)物質(zhì)回收率試驗(yàn)結(jié)果

        2.8 耐用性試驗(yàn)

        按前文所述配制系統(tǒng)適用性溶液,按照相關(guān)測(cè)定方法,每次只改變一個(gè)色譜條件,考察該方法的耐用性,結(jié)果如表7 所示。

        表7 有關(guān)物質(zhì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果

        由表7 可知,進(jìn)樣流速、離子對(duì)試劑比例、色譜柱批號(hào)、柱溫箱溫度等在一定程度下均不影響主藥的測(cè)定,表明該方法的系統(tǒng)耐用性良好。

        3 結(jié)語(yǔ)

        以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[CAPCELL PAK C18MG(4.6 mm×150 mm,3 μm)或效能相當(dāng)?shù)纳V柱],以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫,建立反相高效液相色譜法對(duì)枸櫞酸托法替布片有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),該法靈敏度高、雜質(zhì)分離效果好、耐用性優(yōu)異,溶液質(zhì)量濃度與峰面積相關(guān)性顯著,處方中輔料不干擾藥物含量的測(cè)定,且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、準(zhǔn)確度高,適用于枸櫞酸托法替布有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

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