胡英婕

錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療學(xué)院 （遼寧錦州 121000）

紅景天是《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》收錄的中藥材，為景天科植物大花紅景天的干燥根及根莖；具有益氣活血、通脈平喘功效，用于氣虛血淤、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘等癥[1]。紅景天的有效成分包括紅景天苷、槲皮素、山萘酚、熊果苷等[2-4]。熊果苷具有美白、去色斑、殺菌、消炎的作用，現(xiàn)主要用于高級(jí)化妝品的制備；因其能去除雀斑和黃褐斑，被稱為21 世紀(jì)理想的美白祛斑活性劑[5-7]。本研究以紅景天中有效成分熊果苷為研究對(duì)象，根據(jù)熊果苷提取方法的相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，采用正交試驗(yàn)確定熊果苷的最佳提取方案，并建立高效液相色譜測(cè)定熊果苷含量的方法。該方法對(duì)紅景天用藥質(zhì)量監(jiān)控及熊果苷在化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試劑與儀器

紅景天藥材，經(jīng)錦州成大方圓藥店主任中藥師王景清鑒定為正品；熊果苷對(duì)照品（批號(hào)：120520-201909），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙醇（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸（分析純），天津市康科德科技有限公司；重蒸餾水，自制。

FL2200 高效液相色譜儀，浙江福立分析儀器股份有限公司；ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），北京金歐亞科技發(fā)展有限公司；KQ-100A 超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；BP211D 電子分析天平（精度0.000 01 g），德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；TU-1800 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

A：乙腈－0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（二者體積比為22∶78）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果苷峰峰形不佳，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。

B：甲醇-水-磷酸-三乙胺（四者體積比為47.0∶52.7∶0.2∶0.1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果苷峰和前一個(gè)峰分離度差。

C：甲醇-水（二者體積比為65∶35），加磷酸調(diào)節(jié)pH=3.5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果苷峰保留時(shí)間過短，有拖尾現(xiàn)象。

D：乙腈-磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀6.8 g、三乙胺5 mL、磷酸4 mL，加水1 000 mL）（二者體積比為10∶90）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果苷峰分離度符合要求且峰形好，保留時(shí)間適中。

E：甲醇-乙腈-水（三者體積比為9∶9∶82，加0.1%三乙胺）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果苷峰峰形不佳，分離度小。

5 個(gè)流動(dòng)相比較，D 分離效果較好，且保留時(shí)間適中，柱效高。因此選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀6.8 g、三乙胺5 mL、磷酸4 mL，加水1 000 mL）（二者體積比為10∶90）為熊果苷含量測(cè)定的流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min。2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

因熊果苷具紫外吸收，用紫外檢測(cè)器對(duì)熊果苷對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外全程掃描，其最大吸收波長(zhǎng)在280 nm 處，因此確定熊果苷的檢測(cè)波長(zhǎng)是280 nm。

2.1.3 柱溫的選擇

分別考察不同柱溫（10，20，30 和40 ℃）對(duì)柱效的影響：柱溫在20～30 ℃之間，熊果苷峰峰形無明顯變化，分離效果好，樣品穩(wěn)定，柱效高；柱溫過低或過高，分離效果均較差。因此選擇室溫（23 ℃）為柱溫。

2.2 熊果苷對(duì)照品溶液的配制

取105 ℃干燥至恒重的熊果苷對(duì)照品5.0 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解、稀釋至刻度，即為含熊果苷0.2 mg/mL 的儲(chǔ)備液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍考察

精密吸取熊果苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00 mL，分別置于7 個(gè)25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻, 經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾后，各吸取10 μL，注入高效液相色譜儀。記錄熊果苷對(duì)照品溶液的色譜圖，測(cè)定峰面積，得到進(jìn)樣量（x）和峰面積值（y）的回歸方程：y=854 612x+354 124，r=0.999 0。在0.2～1.4 mg 范圍內(nèi)，熊果苷進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 供試品溶液的制備

提取溶劑、每克原料所用溶劑體積、提取方法、提取時(shí)間均會(huì)對(duì)熊果苷含量測(cè)定有影響，可設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)四因素三水平表，見表1。

表1 熊果苷提取正交試驗(yàn)因素水平表

取紅景天研成粉末（過3 號(hào)篩）約2 g，精密稱定，按照L9（34）正交表設(shè)計(jì)的提取方法分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到熊果苷含量，結(jié)果見表2。熊果苷提取結(jié)果方差分析見表3。

以熊果苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由極差（R）可知，各因素影響作用主次為：C＞A＞D＞B。方差分析結(jié)果表明：A，C因素（提取溶劑、提取方法）影響較大，具顯著意義（p＜0.01）；B，D因素（提取溶劑體積、提取時(shí)間）影響較小，不具顯著意義（p＞0.01）。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，熊果苷最佳提取方案為A3B2C1D2，即用60%乙醇超聲提取50 min，1 g 原料需20 mL 溶劑。

綜上所述，熊果苷提取方案為：取紅景天（過3號(hào)篩）約2 g，精密稱定，用40 mL 的60%乙醇超聲提取50 min，搖勻、濾過，濾液即為供試品溶液。

表2 熊果苷提取L9（34）正交試驗(yàn)分析結(jié)果

表3 熊果苷含量方差分析表

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取熊果苷對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算熊果苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。RSD=0.7%，表明該方法精密度高。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批次紅景天藥材，制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算得到熊果苷含量的RSD=0.9%，表明該方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，20，24 h 進(jìn)樣，根據(jù)峰面積計(jì)算得到熊果苷含量的RSD=0.8%，表明供試品溶液在24 h 之內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的紅景天藥材1.000 克9份，分別按熊果苷含量的80%、100%、120%的量加入熊果苷對(duì)照品（三個(gè)水平，每個(gè)水平2 份），制備成加樣供試品溶液，測(cè)定熊果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 熊果苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

精密吸取不同批次供試品溶液，進(jìn)樣6 次，根據(jù)峰面積計(jì)算得到熊果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為3.2 mg/g，RSD=1.0%。

3 結(jié)語(yǔ)

采用L9(34)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出紅景天中熊果苷的最佳提取工藝。目前美白祛斑化妝品中使用的熊果苷多為合成品，本研究考察了從天然植物藥材紅景天中提取熊果苷的有效方法，為提取天然熊果苷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)天然熊果苷的市場(chǎng)開發(fā)利用具有重要意義。