劉垚杰，劉瑩，李麗維，周王誼，徐閻，王玥，徐詠全，王浩*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天士力研究院，天津 300410）

菊花具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效，在諸多本草古籍中均有記載，是一種藥食同源性的植物。其主要活性因子包括總黃酮和揮發(fā)油類等物質(zhì)[1]。于慧[2]研究發(fā)現(xiàn)菊花具有抗氧化作用。除此以外，菊花水提液能明顯抑制D-半乳糖導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化，降低血中丙二醛含量，提高血中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力[3]。水提法是中藥有效成分提取的常用方法，謝占芳[4]對(duì)該法提取菊花黃酮的成分分析發(fā)現(xiàn)，除黃酮類化合物外，粗提物中還包括一些水溶性淀粉、黏液質(zhì)等無效成分。

引起視疲勞發(fā)生的因素很多，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)視疲勞發(fā)生的主要內(nèi)因之一。唐瓊[5]和王志玲等[6]研究發(fā)現(xiàn)，視疲勞作為一種眼部綜合癥，主要表現(xiàn)為眼癢干澀、畏光流淚等癥狀，而自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物是視疲勞發(fā)生的病理基礎(chǔ)。Sun Liyang等[7]、李濤等[8]和程昱[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能有效地激活肝臟組織中抗氧化基因的表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)相關(guān)抗氧化物質(zhì)的釋放。Naresh等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光進(jìn)入細(xì)胞后，立即被線粒體中的細(xì)胞色素c氧化酶吸收，導(dǎo)致呼吸鏈反應(yīng)增加，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Song Delu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，10 000 Lux光強(qiáng)能夠明顯加劇眼球內(nèi)部的氧化應(yīng)激損傷，并且能夠引起視力功能上的損害。谷炎培等[12]和SONG D等[13]研究顯示長時(shí)間強(qiáng)光照射會(huì)引起晶狀體的損傷，伴隨色素紊亂，并引起晶狀體渾濁現(xiàn)象，其原因可能是眼球內(nèi)部的晶狀體囊受到過量活性氧自由基的攻擊，導(dǎo)致晶狀體代謝出現(xiàn)失衡。

肝臟是人體最重要的代謝和解毒器官。王幼生等[14]發(fā)現(xiàn)，肝組織的不正常代謝與視疲勞有緊密的聯(lián)系，氧化應(yīng)激引起的肝功損傷會(huì)導(dǎo)致維生素A的代謝失衡，從而降低眼對(duì)外界刺激的抵抗能力。桑傳蘭等[15]、KRIGEL A等[16]和TANITO M等[17]研究發(fā)現(xiàn)，過強(qiáng)光照誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性自由基，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)氧化，造成肝功受損。為探討菊花的抗氧化效果，本文采用菊花粗提物為原料，以C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)強(qiáng)光照射后，檢測(cè)晶狀體與肝組織抗氧化指標(biāo)，探討其對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)的視疲勞的緩解作用。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)定試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（分析純，純度＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；復(fù)方托吡卡胺滴眼液：參天制藥（中國）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈陽興齊眼藥股份有限公司。

1.2 菊花粗提物來源

通過水提法制備菊花粗提物[18]（每4.255 g菊花可制得菊花粗提物1 g），采用SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測(cè)定》中植物源性食品總黃酮的測(cè)定方法，測(cè)定提取物總黃酮含量為5.0%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周齡，（18±1）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002），飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[（23±2）℃，相對(duì)濕度55%～75%]。小鼠被放置在白色塑料籠中，每籠4只，每組3籠。動(dòng)物房于7∶00～19∶00給予正常光照，其余時(shí)間無光照。實(shí)驗(yàn)期間為動(dòng)物提供充足的食物和水。本研究的所有實(shí)驗(yàn)程序均按照天津科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.4 動(dòng)物分組及光損傷模型制備

設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)分組，每組12只，期間采用灌胃方式給藥，其中正常對(duì)照組和光損傷模型組每天每只灌胃無菌生理鹽水0.2 mL；菊花粗提物低、中和高劑量組的給藥劑量分別為230、300、380 mg/kg bw，連續(xù)給藥8周。

給藥結(jié)束后進(jìn)行強(qiáng)光造模。造模過程中無外界光源干擾。每只小鼠被單獨(dú)放置在由亞克力透明板制成的小方格中，每個(gè)格子的長、寬、高分別為10、10、8 cm，并在光照前對(duì)小鼠眼球進(jìn)行涂抹眼藥處理，避免眼球表面由于長時(shí)間光照引起脫水。將光照器懸掛于小鼠頂端50 cm處，采用垂直照射方式照射，并在與小鼠同一高度處放置溫度計(jì)，保證溫度維持在（23±2）℃范圍內(nèi)，排除溫度升高引起小鼠眼球光熱損傷的可能。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，照射光強(qiáng)為（9 000±500）Lux，照射時(shí)間為 14 ∶00～18 ∶00，連續(xù)照射 7 d，光照期間正常進(jìn)食與飲水。

正常組、模型組和菊花粗提物低、中、高劑量組分別用NOR、MOD、JHL、JHM和 JHH表示。

1.5 體重及攝食量記錄

體重及攝食量自給藥開始后進(jìn)行記錄，其體重每周稱量一次，共計(jì)8周，攝食量每天測(cè)量一次并記錄。

1.6 晶狀體中相關(guān)抗氧化能力的檢測(cè)

小鼠在脫頸處死后立即摘取眼球，于高倍顯微鏡下，將晶狀體從眼球中分離出來，分離過程在4℃環(huán)境中進(jìn)行。將分離得到的晶狀體組織勻漿，4℃離心10 min（12 000 r/min），吸取上清液，供待檢測(cè)生化指標(biāo)（GSHPx、T-AOC）使用。測(cè)定參照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.7 肝組織中相關(guān)抗氧化能力指標(biāo)檢測(cè)

參考劉佳維等[19]的研究方法，通過小鼠處死后解剖得到肝臟組織，并立即放入-80℃冰箱中保存，供待檢測(cè)生化指標(biāo)（MDA、SOD、CAT、GSH-Px）使用。制備肝組織勻漿時(shí)，取出放置于低溫保存的肝組織，稱取0.1 g肝組織并與0.9 mL無菌生理鹽水混合，在冰浴中將肝組織勻漿。在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液備用。各項(xiàng)指標(biāo)根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果分析

2.1 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠體重與攝食量的影響

菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠體重與攝食量的影響如表1所示。

表1 菊花粗提物對(duì)小鼠體重及攝食量的影響Table 1 Effect of crude extract of chrysanthemum on body weight and food intake of mice

從起始體重和最終體重結(jié)果上看，各組之間的起始體重和最終體重均不顯著（P＞0.05）。從日均攝入量結(jié)果上看，各組小鼠日均攝入量在4 g左右，且各組之間的日均攝食量均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠晶狀體抗氧化結(jié)果分析

菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠晶狀體抗氧化結(jié)果見表2。

表2 各組晶狀體抗氧化指標(biāo)Table 2 Antioxidant index of lens in each group

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠晶狀體內(nèi)GSH-Px活力明顯下降，具有顯著差異（P＜0.05），說明強(qiáng)光照射能夠引起晶狀體抗氧化能力的降低。菊花粗提物各劑量組的晶狀體內(nèi)GSH-Px活力明顯高于模型組，并且菊花粗提物高劑量組的GSH-Px的活力要高于菊花粗提物低劑量組，呈劑量依賴性。與模型組比較，菊花粗提物低、中和高劑量組均差異顯著（P＜0.05）。

T-AOC測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠晶狀體內(nèi)總抗氧化能力明顯下降，具有顯著差異（P＜0.05）。菊花粗提物低、中和高劑量組的總抗氧化能力明顯高于模型組，具有顯著差異（P＜0.05）。低、中和高劑量的菊花粗提物均對(duì)光損傷小鼠晶狀體具有不同程度的保護(hù)作用，并且呈劑量依賴性。

2.3 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠肝組織中各抗氧化指標(biāo)的影響

菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠肝組織中各抗氧化指標(biāo)的影響見表3。

表3 各組小鼠肝組織抗氧化指標(biāo)Table 3 Antioxidant index of liver in each group

2.3.1 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠肝組織中MDA含量的影響

強(qiáng)光照射會(huì)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，其中包括醛基、羰基等。這些過量的活性氧自由基會(huì)破壞體內(nèi)原有的氧化應(yīng)激平衡體系，并且對(duì)生物體內(nèi)DNA的合成及轉(zhuǎn)錄造成影響，使體內(nèi)出現(xiàn)一系列應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。表3結(jié)果表明，長時(shí)間過強(qiáng)的光照會(huì)引起小鼠肝組織中MDA含量顯著增加，而攝入菊花粗提物后，與模型組相比，其MDA含量分別下降16.9%、21.9%和24.4%，并具有顯著差異（P＜0.05）。

2.3.2 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠肝組織中SOD活力的影響

超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)廣泛存在，具有良好的清除自由基的能力，其在體內(nèi)的水平高低與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平直接相關(guān)[22]。表3結(jié)果顯示，長時(shí)間過強(qiáng)的光照會(huì)導(dǎo)致肝組織中SOD活力明顯降低。與模型組比較，菊花粗提物低、中和高劑量組小鼠肝組織中的SOD活力明顯上升，分別提高27.9%、35.5%和42.2%。其中，與模型組比較，均差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠肝組織中CAT活力的影響

過氧化氫酶的主要作用是催化H2O2分解為H2O與O2，能夠減緩氧化應(yīng)激引起的損傷[23]。表3結(jié)果顯示，與正常組相比，光照會(huì)引起肝組織中CAT活力明顯降低（P＜0.05）。給予菊花粗提物連續(xù)干預(yù)8周后，小鼠肝組織中的CAT活力明顯上升，分別提高12.2%、17.3%和32.10%。與模型組相比，菊花粗提物各劑量組均差異顯著（P＜0.05）。

2.3.4 菊花粗提物對(duì)光損傷小鼠肝組織中GSH-Px活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶是機(jī)體中一種重要的過氧化物分解酶[24]。表3結(jié)果顯示，光損傷之后導(dǎo)致肝組織中GSH-Px活力明顯降低。給予菊花粗提物連續(xù)干預(yù)8周后，肝組織中的GSH-Px活力明顯上升，分別提高9.2%、12.0%和13.5%。與模型組相比，菊花粗提物各劑量組均具有顯著性差異（P＜0.05）。

3 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，（9 000±500）Lux光強(qiáng)可以明顯加劇晶狀體和肝組織氧化應(yīng)激過程，引起小鼠晶狀體和肝組織抗氧化能力的下降。光損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，230、300、380 mg/kg bw劑量的菊花粗提物均能夠增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力。晶狀體氧化結(jié)果顯示，菊花粗提物干預(yù)組的GSH-Px活力與T-AOC值明顯高于模型組，呈劑量依賴性。肝臟抗氧化結(jié)果顯示，與模型組相比，低、中和高劑量的菊花粗提物明顯降低了肝組織中MDA含量，升高了SOD、CAT和GSH-Px 3種抗氧化酶的活力，說明3種劑量的菊花粗提物對(duì)肝組織的抗氧化能力均有增強(qiáng)作用。視疲勞是一種眼部綜合癥，晶狀體和肝組織的異常代謝是導(dǎo)致其發(fā)生的重要內(nèi)因，本研究結(jié)果提示，菊花粗提物對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷具有緩解功能，將為菊花視疲勞類視力保護(hù)產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。