李 然

（西安航空學(xué)院 體育部，陜西 西安 710077）

白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥的去皮干燥根，富含多糖、皂苷、蛋白質(zhì)、β-谷甾醇等化學(xué)成分，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗的功效，可用于抗炎、抗病毒、抗驚厥、鎮(zhèn)痛與護(hù)肝[1,2]。目前，有關(guān)白芍的研究，僅限于對其活性成分的提取及藥理作用的探討，如：秦亞東等采用“水提醇沉”工藝制得白芍多糖，并發(fā)現(xiàn)其對羥基自由基、DPPH 自由基等活性氧自由基的清除作用較好[3,4]。由于“運動性疲勞”主要歸因于機(jī)體劇烈運動產(chǎn)生的大量活性氧自由基，破壞體內(nèi)抗氧化與氧化系統(tǒng)的平衡，造成組織損傷和肌肉收縮能力的下降[5,6]，而對機(jī)體補充外源性抗氧化劑是延緩運動性疲勞產(chǎn)生的有效方法之一。近年來，部分體外抗氧化活性較好物質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)其對體內(nèi)抗疲勞亦有較好作用[7,8]。由于白芍多糖提取物中仍有較多蛋白、色素等雜質(zhì)，可能影響其活性作用。為此，本研究利用大孔樹脂純化白芍多糖提取物，探討不同工藝條件對提取物純化效果的影響，同時通過動物實驗，觀察其抗運動性疲勞活性。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

白芍（老百姓大藥房，經(jīng)鑒定為毛茛科芍藥屬植物芍藥的根）；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、無水乙醇、濃H2SO4、苯酚為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸（LD）、尿素氮（BUN）試劑盒為江蘇科特生物科技有限公司生產(chǎn)；實驗用水為超純水；實驗動物：SPF 級健康雄性小鼠 100 只，體質(zhì)量 15～22g。

AB-8、H 103、D 101 型大孔樹脂（天津歐瑞生物科技有限公司）；HPD 400 型大孔樹脂（天津浩聚科技有限公司）；HPD 600 型大孔樹脂（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-06A 粉碎機(jī)（上海燁昌食品機(jī)械有限公司）；752N 型紫外-可見分光光度計（上海儀電科技有限公司）；FA124 型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TG16G 型臺式高速離心機(jī)（常州億能實驗儀器有限公司）；110X50 型水浴恒溫振蕩器（濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 多糖提取物制備

白芍的干燥根經(jīng)粉碎后，稱取適量，經(jīng)無水乙醇浸泡過夜后，在1∶10 固液比下，于80℃熱水浸提2 次，合并提取溶劑，水浴濃縮至原體積三分之一后，在1∶3 固液比下，加入無水乙醇，4℃靜置12h 后離心，收集沉淀，真空干燥，即得白芍多糖粗提物[4]。

1.4 多糖含量測定

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加入5%苯酚溶液和濃H2SO4處理后，于490nm 測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度[9]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=2.391x+0.011（r=0.9994），表明葡萄糖在0.02～0.2mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，另于相同波長，測定實際樣品的吸光度，平行測定3 次，計算樣品中多糖純度。

1.5 樹脂靜態(tài)吸附-解吸性能比較

經(jīng)預(yù)處理后的5.0g 不同型號樹脂置于錐形瓶內(nèi)，分別加入50mL 3mg·mL-1多糖提取液，于室溫振蕩至飽和吸附后過濾，測得飽和吸附后溶液中多糖濃度。隨后，將飽和吸附的大孔樹脂采用純水沖洗至無色后，置于錐形瓶內(nèi)，另加入100mL，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，于相同條件振蕩解吸至平衡，測得乙醇溶液中多糖濃度，計算不同類型大孔樹脂的吸附率、解吸率及回收率[10]。

1.6 樹脂動態(tài)吸附-解吸條件考察

1.6.1 吸附條件考察 固定樣品溶液體積50mL，以吸附率為衡量指標(biāo)，分別考察樣品濃度、上樣液pH值及上樣流速對D101 樹脂吸附白芍多糖的影響，具體如下：當(dāng)上樣液pH 值為5，上樣流速為2mL·min-1，樣品濃度分別為：1、2、3、4、5mg·mL-1；當(dāng)樣品濃度為3mg·mL-1，上樣流速為 2mL·min-1，上樣液 pH 值分別為：3、4、5、6、7；當(dāng)樣品濃度為 3mg·mL-1，上樣液pH 值為 5，上樣流速分別為 1、2、3、4、5mL·min-1。

1.6.2 解吸條件考察 以不同濃度乙醇作洗脫液，解吸率為衡量指標(biāo)，分別考察洗脫液濃度、體積和洗脫流速對解吸率的影響，具體如下：當(dāng)洗脫流速為1mL·min-1，洗脫液體積為 120mL 時，洗脫液濃度分別為：50%、60%、70%、80%、90%；當(dāng)洗脫液濃度為70%，洗脫液體積為120mL 時，洗脫流速分別為0.5、1、2、3、4mL·min-1；當(dāng)洗脫液濃度為 70%，洗脫流速為1mL·min-1時，洗脫液體積分別為100、110、120、130、140mL。

1.7 抗疲勞活性研究

1.7.1 動物分組與劑量設(shè)計 80 只健康雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d 后（飼養(yǎng)環(huán)境溫度：20～25℃，相對濕度：50～70%），按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組，即空白對照組和純化產(chǎn)物的低、中、高劑量組，每組各20 只，根據(jù)《保健食品功能評價》要求，設(shè)計人體推薦攝入劑量的 10、20、30 倍，作為低、中、高劑量組動物每日純化產(chǎn)物的攝入量，即 0.10、0.20、0.30mg·（g·d）-1，空白對照組則給予等量生理鹽水，全部動物每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃30d，灌胃期間各組小鼠可自由喂食與飲水[11]。

1.7.2 力竭游泳時間 末次灌胃結(jié)束后，各組隨機(jī)選取10 只小鼠，于鼠尾負(fù)重5%體重重物，置于游泳池內(nèi)，溫度為（25±2）℃，記錄其自入水游泳至沉沒超過 10s 的時間[12]。

1.7.3 生化指標(biāo)檢測 末次灌胃結(jié)束后，各組剩余動物游泳30min，取出擦凈，休息15min 后，摘眼球取血后離心，制備血清，照相關(guān)試劑盒使用說明，檢測各組小鼠血清中LD 和BUN 的含量[13]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述，利用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05 判斷為差異顯著，P<0.01 判斷為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂靜態(tài)吸附-解吸性能比較

大孔樹脂的吸附與解吸性能與樹脂的極性、比表面積有關(guān)，不同類型樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能，見表1。

表1 不同樹脂的靜態(tài)吸附與解吸性能Tab.1 Static adsorption and desorption performance of different resins

從表1 可見，各類樹脂對白芍多糖的吸附與解吸效果呈明顯差別，其中D 101 樹脂對提取液中多糖的回收率達(dá)到79.1%，其次為H 103，這歸因于多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在較多羥基，具有一定的極性，但H 103 樹脂的比表面積≥900m2·g-1，吸附作用最強，而 D 101 樹脂的比表面積為 500～600m2·g-1，易于脫附，因而確定采用D 101 樹脂作為純化白芍多糖提取物的大孔樹脂。

2.2 樹脂吸附條件優(yōu)化

2.2.1 樣品濃度選擇 不同樣品濃度對樹脂的吸附率影響，見圖1。

圖1 樣品濃度的選擇Fig.1 Selection of concentration of sample solution

由圖1 可見，隨著樣品濃度的增大，吸附率先升高后降低，這歸因于提取物濃度過大，使得樣品中雜質(zhì)增多，競爭吸附于樹脂內(nèi)，導(dǎo)致待分離物的過早泄漏，因此，確定樣品中提取物濃度為3mg·mL-1。

2.2.2 上樣流速選擇 不同上樣流速對樹脂的吸附率影響，見圖2。

圖2 上樣流速的選擇Fig.2 Selection of loading flow rate of sample solution

由圖2 可見，隨著上樣流速的增大，吸附率逐漸下降，這源于流速過快，樣品溶液未與樹脂充分接觸，致使吸附量降低，但流速過慢，可能影響吸附效率。為此，綜合考慮選擇上樣流速為2mL·min-1。

2.2.3 上樣液pH 值選擇 不同上樣液pH 值對樹脂的吸附率影響，見圖3。

圖3 上樣液pH 值的選擇Fig.3 Selection of sample solution pH

由圖3 可見，伴隨上樣液pH 值的增大，吸附率先升高后降低，這可能源于多糖在酸、堿條件下均易發(fā)生水解反應(yīng)，影響其溶解度與化學(xué)性質(zhì)[14]，而在弱酸性條件下，多糖更易于被樹脂吸附，因此確定上樣液pH 值為5。

2.3 樹脂解吸條件優(yōu)化

2.3.1 洗脫液濃度選擇 圖4 為不同洗脫液濃度對多糖解吸率的影響。

由圖4 可見，當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增大至70%時，解吸率開始降低，若乙醇濃度過高，易將吸附在樹脂的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)洗脫，而乙醇濃度過低，則與多糖的極性相差較大，因此，選擇洗脫液乙醇的濃度為70%。

圖4 洗脫液濃度的選擇Fig.4 Selection of eluent concentration

2.3.2 洗脫流速選擇 圖5 為不同洗脫流速對多糖解吸率的影響。

圖5 洗脫流速的選擇Fig.5 Selection of different flow rate of elution

由圖5 可見，隨著洗脫液洗脫流速的增大，多糖的解吸率不斷降低，這歸因于洗脫流速過快，同樣會使洗脫劑與樹脂接觸不充分，導(dǎo)致其解吸多糖效果較差，綜合解吸效率，選擇洗脫流速為1mL·min-1。

2.3.3 洗脫液體積選擇 洗脫液體積對多糖解吸率的影響，見圖6。

圖6 洗脫液體積的選擇Fig.6 Selection of eluent volume

由圖6 可見，隨著洗脫液體積增大至120mL時，解吸率逐漸上升至趨于平衡，表明吸附在樹脂的多糖基本被解吸完全，因此選擇洗脫液體積為120mL。

2.4 驗證實驗

采取上述最佳條件純化白芍提取物中多糖，即配制濃度為 3mg·mL-1，pH 值為 5 的樣品溶液 50mL，以2mL·min-1流速上樣至D 101 樹脂中吸附后，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液120mL，以1mL·min-1流速洗脫，產(chǎn)物的多糖含量由純化前85.57 提高至純化后 224.2mg·g-1，約為 2.6 倍。

2.5 純化產(chǎn)物對動物力竭游泳時間影響

動物力竭游泳實驗可客觀反映白芍多糖的抗運動性疲勞效果，見表2。

表2 白芍多糖對力竭游泳時間的影響Tab.2 Effect of polysaccharide of Radix Paeoniae Alba on exhaustive swimming time

由表2 可知，與空白對照組相比，中、高劑量的純化產(chǎn)物均可顯著延長動物的力竭游泳時間，中劑量組與其差異顯著（P<0.05），而高劑量組與其差異極顯著（P<0.01），表明中、高劑量的白芍多糖純化產(chǎn)物有助于提高機(jī)體的運動耐力，延長運動時間。

2.6 純化產(chǎn)物對動物體內(nèi)乳酸濃度影響

高強度運動時體內(nèi)供氧不足，部分血糖易轉(zhuǎn)化成乳酸，使得四肢肌肉酸痛，出現(xiàn)疲勞感，因此，分別考察運動后不同組別動物體內(nèi)的LD 濃度，結(jié)果見表3。

表3 白芍多糖對LD 濃度的影響Tab.3 Effect of polysaccharide of Radix Paeoniae Alba on LD concentration

由表3 可知，與空白對照組相比，中、高劑量組動物的體內(nèi)LD 濃度均明顯低于空白對照組（P<0.05, P<0.01），表明中、高劑量的純化產(chǎn)物可明顯減少體內(nèi)乳酸的累積，延緩運動疲勞產(chǎn)生。

2.7 純化產(chǎn)物對動物體內(nèi)尿素氮濃度影響

當(dāng)機(jī)體劇烈運動時，血糖供應(yīng)不足，體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加快，以維持運動，致使代謝產(chǎn)物尿素氮濃度增大[25]，運動后不同組別動物體內(nèi)的尿素氮濃度，見表4。

表4 白芍多糖對BUN 濃度的影響Tab.4 Effect of polysaccharide of Radix Paeoniae Alba on BUN concentration

由表4 可知，與空白對照組相比，中、高劑量組動物體內(nèi)的BUN 濃度均明顯低于空白對照組（P<0.05, P<0.01），表明中、高劑量的白芍多糖可顯著減少運動時體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用。

3 結(jié)論

本研究探討了大孔樹脂純化白芍多糖的最佳工藝條件并考察其抗運動性疲勞活性。實驗結(jié)果表明，配制濃度為 3mg·mL-1，pH 值為 5 的樣品溶液 50mL，以2mL·min-1流速上樣至D 101 樹脂中吸附后，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液120mL，以1mL·min-1 流速洗脫，產(chǎn)物的多糖含量由純化前85.57 提高至純化后224.2mg·g-1，約為2.6 倍。中、高劑量的白芍多糖純化產(chǎn)物有助于避免運動時體內(nèi)的乳酸累積，降低蛋白質(zhì)的分解利用，因此，可為相關(guān)運動食品的開發(fā)提供參考。